Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino
Summary
Apresentamos um protocolo para o implante cirúrgico de uma janela óptica de demora estabilizada para imagens de resolução subcelular do pâncreas murino, permitindo estudos seriados e longitudinais do pâncreas sadio e doente.
Abstract
A fisiologia e fisiopatologia do pâncreas são complexas. Doenças do pâncreas, como pancreatite e adenocarcinoma pancreático (ADP), apresentam alta morbidade e mortalidade. A imagem intravital (IVI) é uma técnica poderosa que permite a obtenção de imagens de alta resolução de tecidos em estados saudáveis e doentes, permitindo a observação em tempo real da dinâmica celular. A IVI do pâncreas murino apresenta desafios significativos devido à natureza visceral profunda e complacente do órgão, o que o torna altamente propenso a danos e artefatos de movimento.
Descreve-se aqui o processo de implantação do Stabilizado Window para Intravital imageamento do pâncreas Pmurino (SWIP). O SWIP permite IVI do pâncreas murino em estados normais saudáveis, durante a transformação do pâncreas saudável para pancreatite aguda induzida por ceruleína, e em estados malignos, como tumores pancreáticos. Em conjunto com células geneticamente marcadas ou a administração de corantes fluorescentes, o SWIP permite a medição da dinâmica de célula única e subcelular (incluindo migração de célula única e coletiva), bem como imagens seriadas da mesma região de interesse durante vários dias.
A capacidade de capturar a migração de células tumorais é de particular importância, pois a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a carga metastática esmagadora. A compreensão da dinâmica fisiológica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida e crucial para melhorar o prognóstico dos pacientes. Em geral, o SWIP fornece melhor estabilidade de imagem e expande a aplicação de IVI no pâncreas saudável e doenças malignas do pâncreas.
Introduction
As doenças pancreáticas benignas e malignas são potencialmente fatais, com lacunas consideráveis no entendimento de sua fisiopatologia. A pancreatite, inflamação do pâncreas, é a terceira maior causa de internações e readmissões hospitalares relacionadas a doenças gastrointestinais nos EUA e está associada a substancial morbidade, mortalidade e carga socioeconômica1. Classificado como a terceira causa de morte relacionada aocâncer2, o adenocarcinoma ductal do pâncreas (ADP) é responsável pela maioria das neoplasias malignas pancreáticas3 e prenuncia uma baixa taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 11%2. A principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a sobrecarga metastática. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta doença metastática. Portanto, compreender a dinâmica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida no campo da pesquisa em câncer.
Os mecanismos subjacentes à inflamação e à cascata metastática do pâncreas são pouco compreendidos. Um dos principais contribuintes para essa lacuna no conhecimento é a incapacidade de observar a dinâmica celular pancreática in vivo. A observação direta dessas dinâmicas celulares promete desvendar alvos críticos para alavancar e melhorar o diagnóstico e o tratamento de pessoas com doença pancreática.
A imagem intravital (IVI) é uma técnica de microscopia que permite aos pesquisadores visualizar e estudar processos biológicos em animais vivos em tempo real. O IVI permite a visualização direta e de alta resolução da dinâmica intracelular e microambiental in vivo e dentro do ambiente nativo do processo biológico em questão. Portanto, a IVI permite a observação in vivo de processos patológicos e saudáveis.
As modalidades contemporâneas de imagem de corpo inteiro, como RM, PET e TC, oferecem excelentes visões de órgãos inteiros e podem revelar patologias, mesmo antes do início dos sintomasclínicos4. Eles são incapazes, no entanto, de atingir resolução de célula única ou revelar os estágios iniciais da doença-pancreatite ou malignidade.
Pesquisas anteriores utilizaram IVI de resolução unicelular para observar doenças benignas e malignas de tumores cutâneos5,6, mama7, pulmão8, fígado9, cérebro 10 epâncreas11, levando a insights sobre mecanismos de progressão da doença12. No entanto, o pâncreas murino apresenta obstáculos significativos para alcançar a resolução unicelular usando IVI, principalmente devido à sua localização visceral profunda e alta complacência. Além disso, é um órgão ramificado e difusamente distribuído dentro do mesentério que se conecta ao baço, intestino delgado e estômago, dificultando o acesso. O tecido também é altamente sensível ao movimento causado pelo peristaltismo adjacente e pela respiração. A minimização do movimento do pâncreas é essencial para a microscopia de resolução unicelular, pois artefatos de movimento de até alguns mícrons podem borrar e distorcer as imagens, impossibilitando o rastreamento da dinâmica de células individuais13.
Para a realização da IVI, uma janela de imagem abdominal (AIW) deve ser implantada cirurgicamente 9,11. Para implantar o AIW cirurgicamente, uma moldura de janela metálica é suturada na parede abdominal. Em seguida, o órgão de interesse é fixado ao quadro com adesivo de cianoacrilato. Embora isso seja suficiente para alguns órgãos internos rígidos (por exemplo, fígado, baço, tumores rígidos), as tentativas de obtenção de imagens do pâncreas murino saudável são comprometidas pela estabilidade lateral e axial subótima, devido à textura compatível e à arquitetura complexa do tecido14. Para resolver essa limitação, Park et al.14 desenvolveram uma janela de imagem projetada especificamente para o pâncreas saudável. Esta Janela de Imagem do Pâncreas (PIW) minimiza a influência do movimento intestinal e da respiração, incorporando uma prateleira metálica horizontal dentro da moldura da janela, logo abaixo da lamínula, estabilizando o tecido e mantendo seu contato com o vidro da tampa. Embora o PIP ofereça maior estabilidade lateral, observamos que essa janela ainda demonstra desvio axial e, adicionalmente, impede a obtenção de imagens de grandes tumores sólidos devido ao estreito espaço entre a plataforma metálica e o lamínulo15.
Para resolver essas limitações, desenvolvemos o Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), uma janela de imagem implantável capaz de obter imagens estáveis a longo prazo do pâncreas saudável e doente (Figura 1)15. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para o procedimento cirúrgico usado para implantar o SWIP. Embora o objetivo primário tenha sido estudar os mecanismos dinâmicos envolvidos na metástase, este método também pode ser utilizado para explorar vários aspectos da biologia e patologia do pâncreas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo SWIP descrito aqui fornece um método aprimorado de estabilização do tecido pancreático utilizando uma técnica de cesto de ponto cruzado. As janelas de imagem abdominais precoces (AIWs) permitiram imagens intravitais (IVI) de órgãos internos do abdome, mas não limitaram adequadamente o movimento de tecidos moles, como o pâncreas. Em resposta, Park e col. desenvolveram uma janela de imagem do pâncreas (PIW) que incorpora uma prateleira metálica horizontal e permite uma melhor estabilização do tecid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Evelyn Lipper Charitable Foundation, o Gruss-Lipper Biophotonics Center, o Integrated Imaging Program for Cancer Research, uma bolsa NIH T-32 (CA200561) e um programa de pesquisa de câncer pancreático do Departamento de Defesa (PCARP) concedem PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
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