Presentiamo un protocollo per l’impianto chirurgico di una finestra ottica stabilizzata a permanenza per l’imaging a risoluzione subcellulare del pancreas murino, consentendo studi seriali e longitudinali del pancreas sano e malato.
La fisiologia e la fisiopatologia del pancreas sono complesse. Le malattie del pancreas, come la pancreatite e l’adenocarcinoma pancreatico (PDAC), hanno un’elevata morbilità e mortalità. L’imaging intravitale (IVI) è una potente tecnica che consente l’imaging ad alta risoluzione di tessuti sia in condizioni sane che malate, consentendo l’osservazione in tempo reale delle dinamiche cellulari. L’IVI del pancreas murino presenta sfide significative a causa della natura viscerale profonda e cedevole dell’organo, che lo rende altamente soggetto a danni e artefatti da movimento.
Di seguito è descritto il processo di impianto del P increasmurino (SWIP). Lo SWIP consente l’IVI del pancreas murino in stati di salute normali, durante la trasformazione dal pancreas sano a pancreatite acuta indotta da ceruleina, e in stati maligni come i tumori pancreatici. In combinazione con cellule geneticamente marcate o con la somministrazione di coloranti fluorescenti, lo SWIP consente la misurazione delle dinamiche a singola cellula e subcellulare (compresa la migrazione a singola cellula e collettiva), nonché l’imaging seriale della stessa regione di interesse per più giorni.
La capacità di catturare la migrazione delle cellule tumorali è di particolare importanza in quanto la causa primaria di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Comprendere le dinamiche fisiologiche delle metastasi nel PDAC è un’esigenza critica insoddisfatta e cruciale per migliorare la prognosi del paziente. Nel complesso, lo SWIP fornisce una migliore stabilità dell’imaging ed espande l’applicazione dell’IVI nelle malattie sane del pancreas e del pancreas maligno.
Le malattie pancreatiche benigne e maligne sono potenzialmente pericolose per la vita, con notevoli lacune nella comprensione della loro fisiopatologia. La pancreatite, l’infiammazione del pancreas, è la terza causa principale di ricoveri ospedalieri e riammissioni correlati a malattie gastrointestinali negli Stati Uniti ed è associata a morbilità, mortalità e onere socioeconomicosostanziali. Classificato come la terza causa di morte correlata al cancro 2, l’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresenta la maggior parte delle neoplasie pancreatiche3 e fa presagire uno scarso tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo l’11%2. La principale causa di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Sfortunatamente, la maggior parte dei pazienti presenta una malattia metastatica. Pertanto, la comprensione delle dinamiche delle metastasi nel PDAC è un’esigenza critica insoddisfatta nel campo della ricerca sul cancro.
I meccanismi alla base dell’infiammazione e della cascata metastatica del pancreas sono poco conosciuti. Uno dei principali fattori che contribuiscono a questa lacuna nella conoscenza è l’incapacità di osservare le dinamiche cellulari pancreatiche in vivo. L’osservazione diretta di queste dinamiche cellulari promette di svelare bersagli critici per sfruttare e migliorare la diagnosi e il trattamento delle persone affette da malattie pancreatiche.
L’imaging intravitale (IVI) è una tecnica di microscopia che consente ai ricercatori di visualizzare e studiare i processi biologici negli animali viventi in tempo reale. IVI consente la visualizzazione diretta ad alta risoluzione delle dinamiche intracellulari e microambientali in vivo e all’interno dell’ambiente nativo del processo biologico in questione. Pertanto, l’IVI consente l’osservazione in vivo di processi sani e patologici.
Le moderne modalità di imaging di tutto il corpo come la risonanza magnetica, la PET e la TC offrono un’eccellente visione di interi organi e possono rivelare patologie, anche prima dell’insorgenza dei sintomi clinici4. Non sono in grado, tuttavia, di raggiungere la risoluzione di una singola cellula o di rivelare i primi stadi della malattia-pancreatite o neoplasia.
Ricerche precedenti hanno utilizzato l’IVI a risoluzione singola cellulare per osservare malattie benigne e maligne della pelle5,6, della mammella7, del polmone8, del fegato9, del cervello 10 e dei tumori pancreatici 11, portando a intuizioni sui meccanismi di progressione della malattia 12. Tuttavia, il pancreas murino pone ostacoli significativi al raggiungimento della risoluzione di una singola cellula utilizzando IVI, principalmente a causa della sua posizione viscerale profonda e dell’elevata compliance. Inoltre, è un organo ramificato e diffusamente distribuito all’interno del mesentere che si collega alla milza, all’intestino tenue e allo stomaco, rendendolo di difficile accesso. Il tessuto è anche altamente sensibile al movimento causato dalla peristalsi e dalla respirazione adiacenti. Ridurre al minimo il movimento del pancreas è essenziale per la microscopia a risoluzione di una singola cellula, poiché artefatti da movimento anche di pochi micron possono sfocare e distorcere le immagini, rendendo impossibile il tracciamento della dinamica delle singole cellule13.
Per eseguire l’IVI, è necessario impiantare chirurgicamente una finestra di imaging addominale (AIW) 9,11. Per impiantare chirurgicamente l’AIW, un telaio metallico della finestra viene suturato nella parete addominale. Successivamente, l’organo di interesse viene fissato al telaio utilizzando un adesivo cianoacrilato. Mentre questo è sufficiente per alcuni organi interni rigidi (ad esempio, fegato, milza, tumori rigidi), i tentativi di imaging del pancreas murino sano sono compromessi da una stabilità laterale e assiale non ottimale a causa della struttura conforme del tessuto e dell’architettura complessa14. Per affrontare questa limitazione, Park et al.14 hanno sviluppato una finestra di imaging specificamente progettata per il pancreas sano. Questa finestra per imaging del pancreas (PIW) riduce al minimo l’influenza del movimento intestinale e della respirazione incorporando un ripiano metallico orizzontale all’interno del telaio della finestra, appena sotto il vetrino coprioggetto, stabilizzando il tessuto e mantenendo il contatto con il vetro di copertura. Sebbene il PIW offra una maggiore stabilità laterale, abbiamo scoperto che questa finestra mostra ancora una deriva assiale e impedisce inoltre l’imaging di tumori solidi di grandi dimensioni a causa dello stretto spazio tra il ripiano metallico e il vetrino coprioggetto15.
Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato il Window tabilizzato a Sper l’imagingI ntravitale del Pancreas murino (SWIP), una finestra di imaging impiantabile in grado di ottenere un imaging stabile a lungo termine sia del pancreas sano che di quello malato (Figura 1)15. Qui forniamo un protocollo completo per la procedura chirurgica utilizzata per impiantare lo SWIP. Sebbene l’obiettivo primario fosse quello di studiare i meccanismi dinamici coinvolti nelle metastasi, questo metodo può essere utilizzato anche per esplorare vari aspetti della biologia e della patologia del pancreas.
Il protocollo SWIP qui descritto fornisce un metodo migliorato di stabilizzazione del tessuto pancreatico utilizzando una tecnica a punto croce. Le finestre di imaging addominale precoce (AIW) hanno consentito l’imaging intravitale (IVI) degli organi interni dell’addome, ma non hanno limitato adeguatamente il movimento dei tessuti molli come il pancreas. In risposta, Park et al. hanno sviluppato una finestra di imaging del pancreas (PIW) che incorpora un ripiano metallico orizzontale e consente una migliore stabilizzazio…
The authors have nothing to disclose.
La Evelyn Lipper Charitable Foundation, il Gruss-Lipper Biophotonics Center, l’Integrated Imaging Program for Cancer Research, una borsa di studio NIH T-32 (CA200561) e una sovvenzione del Dipartimento della Difesa Pancreatic Cancer Research Program (PCARP) PA210223P1.
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |