Summary

Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Published: May 12, 2023
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Summary

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l’encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l’epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

Abstract

L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotta dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) richiede l’immunizzazione con un peptide MOG emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA) contenente Mycobacterium tuberculosis inattivato. I componenti antigenici del micobatterio attivano le cellule dendritiche per stimolare le cellule T a produrre citochine che promuovono la risposta Th1 attraverso i recettori toll-like. Pertanto, la quantità e la specie di micobatteri presenti durante la sfida antigenica sono direttamente correlate allo sviluppo di EAE. Questo documento sui metodi presenta un protocollo alternativo per indurre EAE in topi C57BL / 6 utilizzando un adiuvante di Freund incompleto modificato contenente il ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis ucciso dal calore.

M. paratuberculosis, un membro del complesso Mycobacterium avium, è l’agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti ed è stato identificato come un fattore di rischio per diverse malattie umane mediate da cellule T, tra cui la sclerosi multipla. Nel complesso, i topi immunizzati con Mycobacterium paratuberculosis hanno mostrato un esordio precoce e una maggiore gravità della malattia rispetto ai topi immunizzati con CFA contenenti il ceppo di M. tuberculosis H37Ra alle stesse dosi di 4 mg/ml. I determinanti antigenici del ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) sono stati in grado di indurre una forte risposta cellulare Th1 durante la fase effettrice, caratterizzata da un numero significativamente più elevato di linfociti T (CD4+ CD27+), cellule dendritiche (CD11c+ I-A/I-E+) e monociti (CD11b+ CD115+) nella milza rispetto ai topi immunizzati con CFA. Inoltre, la risposta proliferativa delle cellule T al peptide MOG sembrava essere più alta nei topi immunizzati con M. paratubercolosi. L’uso di un encefalogeno (ad esempio, MOG35-55) emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis nella formulazione può essere un metodo alternativo e convalidato per attivare le cellule dendritiche per l’innesco delle cellule T CD4+ specifiche dell’epitopo mielinico durante la fase di induzione dell’EAE.

Introduction

L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello comune per lo studio dei disturbi demielinizzanti umani1. Esistono diversi modelli di EAE: immunizzazione attiva utilizzando diversi peptidi di mielina in combinazione con potenti adiuvanti, immunizzazione passiva mediante trasferimento in vitro di linfociti CD4+ specifici della mielina e modelli transgenici diEAE 2 spontanei. Ognuno di questi modelli ha caratteristiche specifiche che consentono di studiare diversi aspetti dell’EAE, come l’insorgenza, la fase effettrice o la fase cronica. Il modello di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) di EAE è un buon modello per studiare i meccanismi immuno-mediati della neuroinfiammazione cronica e della demielinizzazione, poiché è caratterizzato da infiltrazione infiammatoria mononucleare, demielinizzazione nella sostanza bianca periferica e ridotto recupero dopoil picco 1 della malattia.

MOG-EAE è indotta dall’immunizzazione di topi sensibili con il peptide MOG35-55 in adiuvante completo di Freund (CFA), seguito da un’iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse. Ciò aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica e consente alle cellule T mielina-specifiche attivate nella periferia di raggiungere il sistema nervoso centrale (SNC), dove saranno riattivate3. Il CFA svolge un ruolo chiave nell’induzione dell’EAE migliorando l’assorbimento dell’antigene da parte delle cellule presentanti l’antigene e l’espressione di citochine correlate alle risposte umorali e cellulo-mediate4. Questo meccanismo è dovuto principalmente alla presenza di Mycobacterium tuberculosis ucciso emulsionato nell’olio, i cui componenti forniscono un forte stimolo per il sistema immunitario5. Infatti, l’induzione di EAE è direttamente correlata alla quantità di micobatterio presente durante la sfida antigenica6.

L’aggiunta di altri micobatteri uccisi, come il Mycobacterium butyricum, all’adiuvante7 incompleto di Freund, così come l’effetto delle combinazioni adiuvanti8, possono modulare il decorso clinico dell’EAE e di conseguenza influenzare la riproducibilità dei risultati. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), l’agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti, è stato associato a disturbi infiammatori del SNC umano 9, poiché i suoi componenti antigenici sono in grado di suscitare una forte risposta umorale e cellulo-mediata in pazienti con sclerosi multipla e neuromielite ottica dello spettro9. Pertanto, in questo protocollo, mostriamo un metodo alternativo e riproducibile per indurre MOG-EAE sostituendo M. tuberculosis in CFA con M. paratuberculosis.

Protocol

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Juntendo University School of Medicine (numero di approvazione 290238) e sono stati condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la sperimentazione animale. 1. Osservazioni generali sull’esperimento Ospitare i topi in gabbie individuali nella struttura per animali in condizioni controllate e prive di agenti patogen…

Representative Results

Gruppi di topi C57BL/6 (totale n = 15/gruppo) sono stati immunizzati con MOG35-55 in un’emulsione contenente M. paratubercolosi o con il metodo comune con CFA. Tutti i gruppi di topi hanno manifestato una malattia monofasica acuta caratterizzata da un singolo picco di disabilità osservato a 14-17 giorni, seguito da un parziale recupero dei sintomi nei successivi 10 giorni (Figura 1A). I topi immunizzati con l’adiuvante contenente M. p…

Discussion

Abbiamo dimostrato un robusto protocollo alternativo per indurre attivamente EAE grave in topi C57BL / 6J utilizzando il peptide MOG35-55 emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis10. L’induzione di EAE con questo metodo ha provocato una malattia più grave di quella indotta dal protocollo comune con CFA. Questa differenza potrebbe essere dovuta alle diverse componenti lipidiche nella parete cellulare dei micobatteri11. Infatti, a differe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro ha ricevuto il sostegno di una sovvenzione della Società giapponese per la promozione della scienza (sovvenzione n. JP 23K14675).

Materials

anti-mouse CD115 antibody Biolegend, USA 135505 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody Biolegend, USA 101215 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody Biolegend, USA 117313 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody Biolegend, USA 101302 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody Biolegend, USA 116004 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody Biolegend, USA 100753 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody Biolegend, USA 107635 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody Biolegend, USA 128023 for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment Thermo Fisher Scientific, USA BD 211886 for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice Charles River Laboratory, Japan 3 weeks old, male and female
FBS 10279-106 Gibco Life Techologies, USA 42F9155K for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine Eyela, Tokyo, Japan FDU-1200 for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant Difco Laboratories, MD, USA 263810 for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth Difco Laboratories, MD, USA 90003-876 help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 ATCC, USA BAA-968 bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated BD Biosciences, USA 743-26880-EA for use in adjuvant
Mycobactin J Allied Laboratory, MO, USA growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 AnaSpec, USA AS-60130-10 encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264) Sigma-Aldrich, USA S7951-1MG negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution Fujifilm Wako, Osaka Japan 168-22471 From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100 Kinematica for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine Gibco Life Techologies, USA 11875093 For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi PerkinElmer, Waltham, MA, USA NET027W001MC for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend, USA 423105  cytofluorimetry, for cell viability

References

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Cite This Article
Cossu, D., Tomizawa, Y., Momotani, E., Yokoyama, K., Hattori, N. Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (195), e65422, doi:10.3791/65422 (2023).

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