Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund’s adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.
Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) geïnduceerd door myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) vereist immunisatie door een MOG-peptide geëmulgeerd in volledig Freund’s adjuvans (CFA) met geïnactiveerde Mycobacterium tuberculosis. De antigene componenten van de mycobacterie activeren dendritische cellen om T-cellen te stimuleren om cytokines te produceren die de Th1-respons bevorderen via toll-like receptoren. Daarom zijn de hoeveelheid en soorten mycobacteriën die aanwezig zijn tijdens de antigene uitdaging direct gerelateerd aan de ontwikkeling van EAE. Dit methodedocument presenteert een alternatief protocol om EAE te induceren in C57BL / 6-muizen met behulp van een gemodificeerd onvolledig Freund-adjuvans dat de door hitte gedode Mycobacterium avium-ondersoort paratuberculosestam K-10 bevat.
M. paratuberculosis, een lid van het Mycobacterium avium-complex, is de veroorzaker van de ziekte van Johne bij herkauwers en is geïdentificeerd als een risicofactor voor verschillende menselijke T-cel-gemedieerde aandoeningen, waaronder multiple sclerose. Over het algemeen vertoonden muizen geïmmuniseerd met Mycobacterium paratuberculosis een eerder begin en een grotere ernst van de ziekte dan muizen geïmmuniseerd met CFA die de stam van M. tuberculosis H37Ra bevatten in dezelfde doses van 4 mg / ml. De antigene determinanten van Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) stam K-10 waren in staat om een sterke Th1 cellulaire respons te induceren tijdens de effectorfase, gekenmerkt door significant hogere aantallen T-lymfocyten (CD4+ CD27+), dendritische cellen (CD11c+ I-A/I-E+), en monocyten (CD11b+ CD115+) in de milt in vergelijking met muizen geïmmuniseerd met CFA. Bovendien bleek de proliferatieve T-celrespons op het MOG-peptide het hoogst te zijn bij M. paratuberculosis-geïmmuniseerde muizen. Het gebruik van een encefalitogeen (bijv. MOG35-55) geëmulgeerd in een adjuvans met M. paratuberculose in de formulering kan een alternatieve en gevalideerde methode zijn om dendritische cellen te activeren voor het primen van myeline-epitoopspecifieke CD4+ T-cellen tijdens de inductiefase van EAE.
Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is een gemeenschappelijk model voor de studie van menselijke demyeliniserende aandoeningen1. Er zijn verschillende modellen van EAE: actieve immunisatie met behulp van verschillende myelinepeptiden in combinatie met krachtige adjuvantia, passieve immunisatie door in vitro overdracht van myeline-specifieke CD4 + lymfocyten en transgene modellen van spontane EAE2. Elk van deze modellen heeft specifieke kenmerken waarmee verschillende aspecten van EAE kunnen worden bestudeerd, zoals het begin, de effectorfase of de chronische fase. Het myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) model van EAE is een goed model om de immuungemedieerde mechanismen van chronische neuro-inflammatie en demyelinisatie te bestuderen, omdat het wordt gekenmerkt door mononucleaire inflammatoire infiltratie, demyelinisatie in perifere witte stof en verminderd herstel na de ziektepiek1.
MOG-EAE wordt geïnduceerd door immunisatie van gevoelige muizen met het peptide MOG35-55 in volledig Freund’s adjuvans (CFA), gevolgd door een intraperitoneale injectie van kinkhoesttoxine. Dit verhoogt de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière en zorgt ervoor dat myeline-specifieke T-cellen die in de periferie worden geactiveerd, het centrale zenuwstelsel (CZS) bereiken, waar ze worden gereactiveerd3. CFA speelt een sleutelrol in de inductie van EAE door het verbeteren van de antigeenopname door antigeen-presenterende cellen en de expressie van cytokines gerelateerd aan humorale- en celgemedieerde responsen4. Dit mechanisme is voornamelijk te wijten aan de aanwezigheid van gedode Mycobacterium tuberculosis geëmulgeerd in olie, waarvan de componenten een sterke stimulans vormen voor het immuunsysteem5. In feite is de inductie van EAE direct gerelateerd aan de hoeveelheid mycobacterie die aanwezig is tijdens de antigene uitdaging6.
De toevoeging van andere gedode mycobacteriën, zoals Mycobacterium butyricum, aan het onvolledige adjuvans7 van Freund, evenals het effect van adjuvante combinaties8, kan het klinische beloop van EAE moduleren en bijgevolg de reproduceerbaarheid van de resultaten beïnvloeden. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), de etiologische verwekker van de ziekte van Johne bij herkauwers, is in verband gebracht met ontstekingsstoornissen van het menselijk CZS 9, omdat de antigene componenten ervan in staat zijn om een sterke humorale en celgemedieerde respons op te wekken bij patiënten met multiple sclerose en neuromyelitis optica spectrum stoornis9. Daarom tonen we in dit protocol een alternatieve en reproduceerbare methode om MOG-EAE te induceren door M. tuberculosis in CFA te vervangen door M. paratuberculosis.
We demonstreerden een robuust alternatief protocol om actief ernstige EAE te induceren in C57BL / 6J-muizen met behulp van het peptide MOG35-55 geëmulgeerd in een adjuvans dat M. paratuberculosis10 bevat. De inductie van EAE door deze methode resulteerde in een ernstiger ziekte dan die veroorzaakt door het gemeenschappelijke protocol met CFA. Dit verschil kan te wijten zijn aan de verschillende lipidecomponenten in de celwand van de mycobacteriën11. In…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk kreeg steun van een subsidie van de Japanese Society for the promotion of Science (grant no. JP 23K14675).
anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |