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Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G e ensaio de morte espontânea in vitro

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

Este protocolo detalha a preparação do CLON-G para estender a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias e fornece um procedimento confiável para avaliar a morte de neutrófilos com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência confocal.

Abstract

O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 horas, o que limita a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos com neutrófilos. Nossa pesquisa anterior indicou que múltiplas vias poderiam mediar a morte espontânea de neutrófilos. Um coquetel foi desenvolvido visando simultaneamente essas vias, caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-necroptose inibição mais fator estimulador de colônias de granulócitos (CLON-G), que prolongou a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias sem comprometer significativamente a função dos neutrófilos. Concomitantemente, um protocolo confiável e estável para avaliação e avaliação da morte de neutrófilos também foi desenvolvido. Neste trabalho, mostramos que o CLON-G pode prolongar a vida útil dos neutrófilos in vitro para mais de 5 dias, e exibimos o prolongamento da vida útil dos neutrófilos com FACS e microscopia de fluorescência confocal. Este relato introduz procedimentos para a preparação de CLON-G e mostra um ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos, que pode ser usado para o estudo de neutrófilos e para subsequentemente interrogar a morte de neutrófilos, fornecendo assim um recurso confiável para a comunidade de neutrófilos.

Introduction

Os neutrófilos são conhecidos por compreender um arsenal de grânulos citoplasmáticos abundantes, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, enzimas antimicrobianas e várias organelas que defendem contra micróbios invasores; Além disso, são altamente móveis e são as primeiras células recrutadas para o local da inflamação, ou seja, os neutrófilos são a primeira linha de defesa do sistema imune inato 1,2. A terapia de transfusão de granulócitos tornou-se, portanto, um tratamento clínico promissor para infecções relacionadas à neutropenia para aumentar transitoriamente a imunidade neutrofílica 3,4,5. Descobertas recentes têm mostrado claramente que os neutrófilos também funcionam como efetores multifacetados em muitos cenários fisiopatológicos6. O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 h e, portanto, a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos de neutrófilos são tremendamente difíceis devido às limitações relacionadas à manipulação genética estável e ao armazenamento a longo prazo 7,8,9,10,11 . Existem algumas linhagens celulares que podem apresentar parcialmente algumas funções neutrófilas, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 e células-tronco pluripotentesinduzidas12. Essas linhagens celulares podem alcançar edição gênica e criopreservação; no entanto, eles ainda diferem imensamente dos neutrófilos primários e, portanto, não podem recapitular fielmente as funções dos neutrófilos13. Assim, a maior parte da pesquisa nesse campo ainda se baseia em neutrófilos primários recém-isolados. O campo ainda depende da geração de camundongos knock-out condicionais caros e demorados para investigar funções gênicas específicas em neutrófilos, mas nenhum modelo humano existe atualmente.

Tendo nos empenhado em explorar os processos heterogêneos envolvidos na morte de neutrófilos e as múltiplas vias que regulam esses processos14,15, um novo tratamento denominado CLON-G (caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-inibição da necroptose mais fator estimulador de colônias de granulócitos) foi recentemente relatado 16. O CLON-G consiste em Q-VD-oph (quinolil-valil-O-metilaspartil-[-2,6-difluorofenoxi]-metil cetona), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) e G-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos). A morte espontânea dos neutrófilos é mediada por múltiplas vias, incluindo apoptose, necroptose e piroptose. A Q-VD-OPH inibe a apoptose de neutrófilos como inibidor da pan-caspase, tendo como alvo a caspase 1, caspase 3, caspase 8 e caspase9 17. A necroptose neutrofílica é dependente de uma via de sinalização envolvendo a proteína quinase-1 de interação com o receptor (RIPK1) e a proteína de domínio semelhante ao domínio da linhagem mista de linhagem quinase (MLKL)18. Como um inibidor de RIPK1, Nec-1s inibem a necroptose de neutrófilos. Hsp70 e DFO podem inibir a permeabilização da membrana lisossômica (LMP), o que poderia induzir apoptose neutrofílica19 e piroptose20. As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham papéis vitais na morte de neutrófilos, mediando LMP19 e apoptose21 e inibindo sinais de sobrevivência22. Como um antioxidante que pode reduzir o acúmulo de EROs, NAC retarda a morte de neutrófilos. Como fator de crescimento, o G-CSF ativa sinais de sobrevivência de neutrófilos e inibe a apoptose induzida pela calpaína23,24. Ao visar simultaneamente múltiplas vias de morte espontânea de neutrófilos, o tempo de vida dos neutrófilos pode ser efetivamente estendido para mais de 5 dias sem comprometer sua função. O tratamento com CLON-G amplia as possibilidades de preservação, transporte e manipulação gênica de neutrófilos, o que pode acelerar a pesquisa na comunidade de neutrófilos. Enquanto isso, com base no conhecimento da morte de neutrófilos, os protocolos atualmente aprovados para ensaios de morte celular podem causar danos inesperados aos neutrófilos14, de modo que esses protocolos foram refinados para serem mais apropriados para estudos com neutrófilos. Este relatório fornece protocolos detalhados para cultura de neutrófilos com CLON-G e um ensaio in vitro de morte celular de neutrófilos de camundongos usando citometria de fluxo e imagem de fluorescência. O CLON-G é eficaz em neutrófilos humanos e de camundongos; no entanto, as amostras de camundongos são demonstradas aqui para simplificar esse protocolo. A concentração de NAC é de 1 mM para neutrófilos de camundongos e 10 μM para neutrófilos humanos. A Hsp70 é espécie-específica e, portanto, deve ser utilizada de acordo com a fonte do neutrófilo. Para este protocolo, não importa se os neutrófilos são isolados do sangue periférico ou da medula óssea e como são isolados.

Para o presente estudo, os neutrófilos foram isolados da medula óssea de camundongos para obter neutrófilos suficientes para os experimentos, pois cerca de 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrófilos podem ser obtidos da medula óssea, enquanto apenas 1 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados do sangue periférico de um único camundongo C57BL/6 de 8-12 semanas de idade (de ambos os sexos). A centrifugação por gradiente foi realizada para evitar possíveis danos e ativação a partir da estimulação mecânica da classificação FACS ou MACS.

Protocol

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children’s Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) aprovou e monitorou todos os procedimentos. A Figura 1 apresenta o fluxograma da cultura de neutrófilos com CLON-G e o ensaio de morte in vitro . 1. Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G NOTA: Todas as operações e materiais mencionados devem ser estéreis. Certifique-se…

Representative Results

A morfologia corada por Wright-Giemsa (Figura 2A-D) e os fenótipos FACS (Figura 2E-J) dos neutrófilos tratados com CLON-G não foram afetados. A viabilidade dos neutrófilos tratados com CLON-G em 24 h foi de cerca de 90%+ com base na análise por citometria de fluxo (Figura 3) e nos ensaios de imagem fluorescente (Figura 4). Menor vi…

Discussion

Os neutrófilos desempenham papéis vitais na imunidade inata e adaptativa, e sua homeostase é fortemente regulada. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico humano e têm um turnover robusto e rápido. Um adulto saudável pode liberar 1 x 109 neutrófilos/kg diariamente da medula óssea28. A morte dos neutrófilos tornou-se, portanto, um dos enigmas intrigantes desse campo, e muito esforço tem sido dedicado para melhor compreendê-los. Acredita-se que …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projeto foi apoiado pelo Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), pelo Fundo de Inovação para Ciências Médicas da Academia Chinesa de Ciências Médicas (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), pelo Fundo Especial de Pesquisa para Universidades Centrais, pela Faculdade de Medicina da União de Pequim (3332022062) e pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (NO. 2021YJ0480).

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
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