JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

تمديد عمر العدلات مع CLON-G ومقايسة الموت التلقائي في المختبر

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

يفصل هذا البروتوكول إعداد CLON-G لإطالة عمر العدلات إلى أكثر من 5 أيام ويوفر إجراء موثوقا به لتقييم موت العدلات باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلوري متحد البؤر.

Abstract

متوسط عمر العدلات أقل من 24 ساعة ، مما يحد من الأبحاث الأساسية حول العدلات وتطبيق دراسات العدلات. أشار بحثنا السابق إلى أن المسارات المتعددة يمكن أن تتوسط في الموت التلقائي للعدلات. تم تطوير كوكتيل من خلال استهداف هذه المسارات في وقت واحد ، وتثبيط نفاذية غشاء الكاسباس – الليزوزومي – المؤكسد – التنخر بالإضافة إلى عامل تحفيز مستعمرة المحببات (CLON-G) ، والذي يطيل عمر العدلات إلى أكثر من 5 أيام دون المساس بشكل كبير بوظيفة العدلات. في الوقت نفسه ، تم تطوير بروتوكول موثوق ومستقر لتقييم وتقييم موت العدلات. في هذا العمل ، نظهر أن CLON-G يمكن أن يطيل عمر العدلات في المختبر إلى أكثر من 5 أيام ، ونعرض إطالة عمر العدلات باستخدام FACS والفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. يقدم هذا التقرير إجراءات لإعداد CLON-G ويعرض مقايسة الموت التلقائي في المختبر للعدلات ، والتي يمكن استخدامها لدراسة العدلات ولاستجواب موت العدلات لاحقا ، وبالتالي توفير مورد موثوق لمجتمع العدلات.

Introduction

من المعروف أن العدلات تتكون من ترسانة من حبيبات السيتوبلازم الوفيرة ، نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات (NADPH) أوكسيديز ، الإنزيمات المضادة للميكروبات ، والعضيات المختلفة التي تدافع ضد الميكروبات الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، فهي شديدة الحركة وهي الخلايا الأولى التي يتم تجنيدها إلى موقع الالتهاب ، مما يعني أن العدلات هي خط الدفاع الأول لجهاز المناعة الفطري 1,2. وبالتالي أصبح العلاج بنقل الخلايا المحببة علاجا سريريا واعدا للعدوى المرتبطة بقلة العدلات لتعزيز مناعة العدلات بشكل عابر3،4،5. أظهرت الاكتشافات الحديثة بوضوح أن العدلات تعمل أيضا كمستجيبات متعددة الأوجه في العديد من السيناريوهات الفسيولوجيةالمرضية 6. متوسط عمر العدلات أقل من 24 ساعة ، وبالتالي ، فإن الأبحاث الأساسية حول العدلات وتطبيق دراسات العدلات صعبة للغاية بسبب القيود المتعلقة بالتلاعب الجيني المستقر والتخزين طويل الأجل7،8،9،10،11. هناك بعض خطوط الخلايا التي يمكن أن تعرض جزئيا بعض وظائف العدلات ، مثل HL-60 و PLB-985 و NB4 و Kasumi-1 والخلايا الجذعية المستحثةمتعددة القدرات 12. يمكن أن تحقق خطوط الخلايا هذه تحريرا فعالا للجينات وحفظها بالتبريد. ومع ذلك ، فإنها لا تزال تختلف اختلافا كبيرا عن العدلات الأولية ، وبالتالي ، لا يمكنها تلخيص وظائف العدلات بأمانة13. وبالتالي ، فإن معظم الأبحاث في هذا المجال لا تزال تعتمد على العدلات الأولية المعزولة حديثا. لا يزال المجال يعتمد على توليد فئران مشروطة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا للتحقيق في وظائف جينية محددة في العدلات ، ولكن لا توجد نماذج بشرية حاليا.

بعد أن بذلنا جهودنا في استكشاف العمليات غير المتجانسة التي ينطوي عليها موت العدلات والمسارات المتعددة التي تنظم هذه العمليات 14,15 ، تم الإبلاغ مؤخرا عن علاج جديد يسمى CLON-G (نفاذية الغشاء الليزوزومي – المؤكسد – تثبيط التنخر بالإضافة إلى عامل تحفيز مستعمرة المحببات) 16. يتكون CLON-G من Q-VD-oph (كينوليل – فاليل-O-ميثيل أسبارتيل- [-2،6-ثنائي فلورو فينوكسي] – ميثيل كيتون) ، Hsp70 (بروتين الصدمة الحرارية 70) ، DFO (ديفيروكسامين) ، NAC (N-أسيتيل سيستئين) ، Nec-1s (نيكروستاتين -1s) ، و G-CSF (عامل تحفيز مستعمرة المحببات). يتم التوسط في الموت التلقائي للعدلات من خلال مسارات متعددة ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، والتنخر ، والبيروبتوس. Q-VD-oph يثبط موت الخلايا المبرمج للعدلات كمثبط لعموم الكاسباز عن طريق استهداف الكاسباز 1 ، الكاسباز 3 ، الكاسباز 8 ، والكاسباز 917. يعتمد نخر العدلات على مسار إشارات يتضمن بروتين كيناز -1 المتفاعل مع المستقبلات (RIPK1) وبروتين شبيه بمجال كيناز مختلط السلالة (MLKL)18. كمثبط ل RIPK1 ، تمنع Nec-1s نخر العدلات. يمكن أن يمنع Hsp70 و DFO نفاذية الغشاء الليزوزومي (LMP) ، والتي يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمجالعدلات 19 و pyroptosis20. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا حيوية في موت العدلات عن طريق التوسط في LMP19 وموت الخلايا المبرمج21 وتثبيط إشارات البقاء على قيد الحياة22. كمضاد للأكسدة يمكن أن يقلل من تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية ، يؤخر NAC موت العدلات. كعامل نمو ، ينشط G-CSF إشارات بقاء العدلات ويمنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن كالبين23,24. من خلال استهداف مسارات الموت العفوية المتعددة للعدلات في وقت واحد ، يمكن تمديد عمر العدلات بشكل فعال إلى أكثر من 5 أيام دون المساس بوظيفتها. يوسع علاج CLON-G إمكانيات الحفاظ على العدلات ونقلها والتلاعب بالجينات ، والتي يمكن أن تسرع البحث في مجتمع العدلات. وفي الوقت نفسه ، بناء على معرفة موت العدلات ، يمكن أن تسبب البروتوكولات المعتمدة حاليا لمقايسات موت الخلايا أضرارا غير متوقعة للعدلات14 ، لذلك تم تحسين هذه البروتوكولات لتكون أكثر ملاءمة لدراسات العدلات. يقدم هذا التقرير بروتوكولات مفصلة لزراعة العدلات باستخدام CLON-G ومقايسة موت الخلايا في المختبر لعدلات الفئران باستخدام قياس التدفق الخلوي والتصوير الفلوري. CLON-G فعال على كل من العدلات الفأر والإنسان. ومع ذلك ، يتم عرض عينات الماوس هنا لتبسيط هذا البروتوكول. تركيز NAC هو 1 mM للعدلات الفئران و 10 μM للعدلات البشرية. Hsp70 خاص بالأنواع ، وبالتالي ، يجب استخدامه وفقا لمصدر العدلات. بالنسبة لهذا البروتوكول ، لا يهم ما إذا كانت العدلات معزولة عن الدم المحيطي أو نخاع العظم وكيف يتم عزلها.

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم عزل العدلات من نخاع عظم الفأر لتحقيق ما يكفي من العدلات للتجارب ، حيث يمكن الحصول على حوالي 1 × 10 7-1.5 × 107 عدلات من نخاع العظم ، بينما يمكن عزل 1 × 10 6 عدلات فقط من الدم المحيطي لفأر واحد عمره 8-12 أسبوعا C57BL /6 (من أي من الجنسين). تم إجراء الطرد المركزي المتدرج لتجنب الضرر المحتمل والتنشيط من التحفيز الميكانيكي لفرز FACS أو فرز MACS.

Protocol

وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مستشفى بوسطن للأطفال والمختبر الرئيسي لأمراض الدم التجريبية (SKLEH) على جميع الإجراءات وراقبتها. يصور الشكل 1 مخططا انسيابيا لزراعة العدلات باستخدام CLON-G ومقايسة الموت في المختبر . 1. تمديد عمر العدلات مع CLON-G <…

Representative Results

لم يتأثر مورفولوجيا رايت جيمسا الملطخة (الشكل 2A-D) والأنماط الظاهرية FACS (الشكل 2E-J) للعدلات المعالجة CLON-G. كانت صلاحية العدلات المعالجة ب CLON-G عند 24 ساعة حوالي 90٪ + بناء على تحليل قياس التدفق الخلوي (الشكل 3) و?…

Discussion

تلعب العدلات أدوارا حيوية في المناعة الفطرية والتكيفية، وينظم توازنها بإحكام. العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي البشري ، ولها دوران قوي وسريع. يمكن للبالغين الأصحاء إطلاق 1 × 109 عدلات / كجم يوميا من نخاع العظم28. وبالتالي أصبح موت العدلات أحد الألغاز ال?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا المشروع من قبل مختبر Haihe لصندوق ابتكار النظام البيئي للخلايا (22HHXBSS00036 ، 22HHXBSS00019) ، وصندوق الابتكار للعلوم الطبية التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) (2021-I2M-1-040،2022-I2M-JB-015) ، وصندوق البحوث الخاص للجامعات المركزية ، وكلية الطب في اتحاد بكين (3332022062) ، وبرنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (رقم 2021YJ0480).

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annual Review of Immunology. 23, 197-223 (2005).
  2. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
  3. Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
  4. Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
  5. Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
  6. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
  7. Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
  8. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  9. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  10. Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
  11. McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
  12. Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
  13. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  14. Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H. Heterogeneity of neutrophil spontaneous death. American Journal of Hematology. 92 (8), E156-E159 (2017).
  15. Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
  16. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  17. Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
  18. Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U. Necroptosis and neutrophil-associated disorders. Cell Death and Disorders. 9 (2), 111 (2018).
  19. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  20. Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
  21. Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
  22. Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
  23. van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
  24. Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
  25. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  26. Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
  27. Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
  28. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  29. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death and Differentiation. 6 (2), 99-104 (1999).
  30. Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
  31. Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
  32. Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
  33. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  34. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  35. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  36. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  37. Zhang, D. -. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
  38. Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -. U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
  39. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  40. George, B., Bhattacharya, S., Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. , (2020).
  41. Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
  42. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  43. Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
  44. Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
  45. Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).

Tags

Neutrophil LifespanCLON-GIn Vitro Spontaneous Death AssayNeutrophil PreservationNeutrophil TransportationNeutrophil Gene ManipulationFlow CytometryFluorescent ImagingCell Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image