Ex Vivo Expansión y manipulación genética de células madre hematopoyéticas de ratón en cultivos a base de alcohol polivinílico
Summary
Aquí se presenta un protocolo para iniciar, mantener y analizar cultivos de células madre hematopoyéticas de ratón utilizando expansión ex vivo a base de alcohol polivinílico, así como métodos para manipularlos genéticamente mediante transducción lentiviral y electroporación.
Abstract
Las células madre hematopoyéticas multipotentes (HSC) autorrenovadoras son un tipo de célula importante debido a su capacidad para apoyar la hematopoyesis durante toda la vida y reconstituir todo el sistema sanguíneo después del trasplante. Las HSC se utilizan clínicamente en terapias de trasplante de células madre, que representan un tratamiento curativo para una variedad de enfermedades de la sangre. Existe un interés sustancial tanto en comprender los mecanismos que regulan la actividad de HSC y la hematopoyesis, como en desarrollar nuevas terapias basadas en HSC. Sin embargo, el cultivo estable y la expansión de HSC ex vivo ha sido una barrera importante en el estudio de estas células madre en un sistema ex vivo tratable. Recientemente desarrollamos un sistema de cultivo a base de alcohol polivinílico que puede apoyar la expansión a largo plazo y a gran escala de HSC de ratón trasplantables y métodos para editarlas genéticamente. Este protocolo describe métodos para cultivar y manipular genéticamente HSC de ratón a través de electroporación y transducción lentiviral. Se espera que este protocolo sea útil para una amplia gama de hematólogos experimentales interesados en la biología de HSC y la hematopoyesis.
Introduction
El sistema hematopoyético apoya una serie de procesos esenciales en mamíferos, desde el suministro de oxígeno hasta la lucha contra patógenos, pasando por la sangre especializada y los tipos de células inmunes. La producción continua de sangre (hematopoyesis) es necesaria para apoyar la homeostasis del sistema sanguíneo, que es sostenida por células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC)1. La célula hematopoyética más primitiva es la célula madre hematopoyética (HSC), que tiene capacidades únicas para la autorrenovación y la diferenciación multilinaje 2,3. Esta es una población celular rara, que se encuentra principalmente en la médula ósea adulta4, donde ocurren con una frecuencia de aproximadamente una cada 30,000 células. Se cree que las HSC apoyan la hematopoyesis de por vida y ayudan a restablecer la hematopoyesis después del estrés hematológico. Estas capacidades también permiten a las HSC reconstituir de manera estable todo el sistema hematopoyético después del trasplante en un receptor irradiado5. Esto representa la definición funcional de un HSC y también constituye la base científica para la terapia de trasplante de HSC, un tratamiento curativo para una variedad de enfermedades sanguíneas e inmunes6. Por estas razones, las HSC son un foco importante de la hematología experimental.
A pesar de un gran enfoque de investigación, ha seguido siendo un desafío expandir de manera estable las HSC ex vivo7. Recientemente hemos desarrollado el primer sistema de cultivo de expansión ex vivo a largo plazo para HSC de ratón8. El enfoque puede ampliar las HSC trasplantables en 234-899 veces durante un cultivo de 4 semanas. En comparación con los enfoques alternativos, el cambio importante en el protocolo fue la eliminación de la albúmina sérica y su reemplazo por un polímero sintético. El alcohol polivinílico (PVA) se identificó como un polímero óptimo para los cultivos HSC de ratón8, que ahora también se ha utilizado para cultivar otros tipos de células hematopoyéticas9. Sin embargo, también se ha identificado recientemente otro polímero llamado Soluplus (un copolímero de injerto de polivinilo caprolactama-acetato-polietilenglicol), que parece mejorar la expansión clonal de HSC10. Antes del uso de polímeros, se usaba albúmina sérica en forma de suero bovino fetal, fracción V de albúmina sérica bovina o albúmina sérica recombinante, pero estos tenían un apoyo limitado para la expansión de HSC y solo apoyaban cultivo ex vivo a corto plazo (~ 1 semana)7. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los protocolos de cultivo de HSC que retienen las HSC en estado de reposo pueden soportar un tiempo de cultivo ex vivo más largo11,12.
En comparación con otros métodos de cultivo, una ventaja importante de los cultivos basados en PVA es el número de células que se pueden generar y el tiempo que el protocolo se puede utilizar para rastrear HSC ex vivo. Esto supera varias barreras en el campo de la hematología experimental, como el bajo número de HSC aislables por ratón (solo unos pocos miles) y la dificultad de rastrear HSC a lo largo del tiempo in vivo. Sin embargo, es importante recordar que estos cultivos estimulan la proliferación de HSC, mientras que el pool de HSC in vivo es predominantemente inactivo en estado estacionario13. Además, aunque los cultivos son selectivos para las HSC, los tipos de células adicionales se acumulan con los cultivos con el tiempo, y las HSC trasplantables solo representan aproximadamente una de cada 34 células después de 1 mes. Las células progenitoras hematopoyéticas mieloides parecen ser el principal tipo de célula contaminante en estos cultivos de HSC8. Sin embargo, podemos usar estos cultivos para enriquecer las HSC de poblaciones celulares heterogéneas (por ejemplo, c-Kit+ HSPC de médula ósea14). También apoya la transducción o electroporación de HSCs para manipulación genética14,15,16. Para ayudar a identificar las HSC de la población heterogénea cultivada de HSPC, CD201 (EPCR) se ha identificado recientemente como un marcador útil ex vivo HSC 10,17,18, con HSC trasplantables restringidas a la fracción CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Linaje–.
Este protocolo describe métodos para iniciar, mantener y evaluar cultivos de expansión de HSC de ratón basados en PVA, así como protocolos para la manipulación genética dentro de estos cultivos mediante electroporación o transducción de vectores lentivirales. Se espera que estos métodos sean útiles para una variedad de hematólogos experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esperamos que este protocolo proporcione un enfoque útil para investigar la biología de HSC, la hematopoyesis y la hematología en general. Desde el desarrollo inicial del método de cultivo basado en PVA para HSC purificadas con FACS8, el método se ha ampliado. Por ejemplo, se ha demostrado que el método funciona con c-Kit enriquecido con médula ósea y con placas cargadas superficialmente negativas14. También se ha demostrado su compatibilidad con transducción y el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al WIMM Flow Cytometry Core por el acceso a la citometría de flujo, y al WIMM Virus Screening Core por la generación de vectores lentivirales. Este trabajo fue financiado por el Fondo contra la Leucemia Kay Kendall y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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