אקס ויוו הרחבה ומניפולציה גנטית של תאי גזע המטופויטיים של עכברים בתרביות מבוססות אלכוהול פוליוויניל
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לייזום, תחזוקה וניתוח של תרביות תאי גזע המטופויטיים של עכברים באמצעות הרחבה מבוססת אלכוהול פוליוויניל ex vivo , כמו גם שיטות למניפולציה גנטית שלהם על ידי התמרה לנטיווירלית ואלקטרופורציה.
Abstract
תאי גזע המטופויטיים רב-פוטנטיים המתחדשים מעצמם (HSC) הם סוג תא חשוב בשל יכולותיהם לתמוך בהמטופוייזה לאורך כל החיים ולבנות מחדש את מערכת הדם כולה לאחר ההשתלה. HSCs משמשים קלינית בטיפולי השתלת תאי גזע, המייצגים טיפול מרפא למגוון מחלות דם. יש עניין רב הן בהבנת המנגנונים המווסתים את פעילות HSC והמטופויזיס, והן בפיתוח טיפולים חדשים מבוססי HSC. עם זאת, התרבית היציבה וההתרחבות של HSCs ex vivo היוו מחסום מרכזי בחקר תאי גזע אלה במערכת אקס ויוו טרקטיבית. לאחרונה פיתחנו מערכת תרבית מבוססת אלכוהול פוליוויניל שיכולה לתמוך בהרחבה ארוכת טווח ובקנה מידה גדול של HSCs עכברים מושתלים ושיטות לערוך אותם גנטית. פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבית ומניפולציה גנטית של HSCs עכברים באמצעות אלקטרופורציה והתמרה לנטיוויראלית. פרוטוקול זה צפוי להיות שימושי למגוון רחב של המטולוגים ניסיוניים המעוניינים בביולוגיה של HSC והמטופואזיס.
Introduction
המערכת ההמטופויטית תומכת במגוון תהליכים חיוניים ביונקים, החל מאספקת חמצן ועד לחימה בפתוגנים, דרך סוגי דם מיוחדים ותאי חיסון. ייצור דם רציף (hematopoiesis) נדרש לתמיכה בהומאוסטזיס של מערכת הדם, אשר נתמך על ידי תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs)1. התא ההמטופויטי הפרימיטיבי ביותר הוא תא גזע המטופויטי (HSC), בעל יכולות ייחודיות להתחדשות עצמית והתמיינות רב-שושלות 2,3. זוהי אוכלוסיית תאים נדירה, המצויה בעיקר במח עצם4 הבוגר, שם הם מופיעים בתדירות של אחד בלבד לכל 30,000 תאים. מאמינים כי HSCs תומכים בהמטופויזה לכל החיים ועוזרים לבסס מחדש את ההמטופויזה לאחר לחץ המטולוגי. יכולות אלה גם מאפשרות ל-HSCs לבנות מחדש ביציבות את כל המערכת ההמטופויטית לאחר השתלה במושתל מוקרן5. זה מייצג את ההגדרה הפונקציונלית של HSC וגם מהווה את הבסיס המדעי לטיפול השתלת HSC, טיפול מרפא למגוון מחלות דם וחיסון6. מסיבות אלה, HSCs הם מוקד עיקרי של המטולוגיה ניסיונית.
למרות מיקוד גדול של מחקר, זה נשאר מאתגר להרחיב ביציבות HSCs ex vivo7. לאחרונה פיתחנו את מערכת תרבית ההרחבה הראשונה לטווח ארוך ex vivo עבור HSCsעכבר 8. הגישה יכולה להרחיב את HSCs להשתלה פי 234-899 על פני תרבית של 4 שבועות. בהשוואה לגישות חלופיות, השינוי העיקרי בפרוטוקול היה הסרת אלבומין בסרום והחלפתו בפולימר סינתטי. אלכוהול פוליוויניל (PVA) זוהה כפולימר אופטימלי עבור תרביות HSC8 של עכבר, אשר שימש כעת גם לתרבית סוגי תאים המטופויטיים אחרים9. עם זאת, פולימר נוסף בשם Soluplus (פוליוויניל caprolactam-אצטט-פוליאתילן גליקול שתל קופולימר) זוהה גם הוא לאחרונה, אשר נראה כי הוא משפר את הרחבת HSC השבט10. לפני השימוש בפולימרים, אלבומין בסרום בצורה של סרום בקר עוברי, אלבומין בסרום בקר V, או אלבומין בסרום רקומביננטי, אך אלה תמכו באופן מוגבל בהרחבת HSC ותמכו רק בתרבית ex vivo לטווח קצר (~ 1 שבוע)7. עם זאת, יש לציין כי פרוטוקולי תרבות HSC השומרים על HSC במצב שקט יכולים לתמוך בזמן תרבות ex vivo ארוך יותר11,12.
בהשוואה לשיטות תרבית אחרות, יתרון מרכזי של תרביות מבוססות PVA הוא מספר התאים שניתן לייצר ומשך הזמן שניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לעקוב אחר HSCs ex vivo. זה מתגבר על כמה חסמים בתחום ההמטולוגיה הניסויית, כגון המספר הנמוך של HSCs לבודד לכל עכבר (רק כמה אלפים) ואת הקושי לעקוב אחר HSCs לאורך זמן in vivo. עם זאת, חשוב לזכור כי תרבויות אלה מעוררות את התפשטות HSC, בעוד שמאגר ה- HSC in vivo הוא בעיקר שקט במצב יציב13. בנוסף, למרות שהתרביות סלקטיביות עבור HSCs, סוגי תאים נוספים מצטברים עם התרביות לאורך זמן, ותאי HSC להשתלה מייצגים רק אחד מכל 34 תאים לאחר חודש אחד. תאי אב מיאלואידים המטופויטיים נראים כסוג התא המזהם העיקרי בתרביות HSC אלה8. אף על פי כן, אנו יכולים להשתמש בתרביות אלה כדי להעשיר עבור HSCs מאוכלוסיות תאים הטרוגניות (למשל, c-Kit+ מח עצם HSPCs14). הוא תומך גם בהתמרה או אלקטרופורציה של HSCs למניפולציה גנטית14,15,16. כדי לסייע בזיהוי HSCs מאוכלוסיית HSPC בתרבית הטרוגנית, CD201 (EPCR) זוהה לאחרונה כסמן HSC שימושי ex vivo 10,17,18, כאשר HSCs הניתנים להשתלה מוגבלים לשבר CD201+CD150+c-Kit+Sca1+שושלת.
פרוטוקול זה מתאר שיטות ליזום, לתחזק ולהעריך תרביות הרחבת HSC עכבר מבוססות PVA, כמו גם פרוטוקולים למניפולציה גנטית בתוך תרבויות אלה באמצעות אלקטרופורציה או התמרה וקטורית לנטיויראלית. שיטות אלה צפויות להיות שימושיות עבור מגוון של המטולוגים ניסיוניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מקווים כי פרוטוקול זה מספק גישה שימושית לחקור ביולוגיה HSC, hematopoiesis, והמטולוגיה באופן כללי יותר. מאז הפיתוח הראשוני של שיטת התרבית מבוססת PVA עבור HSCsמטוהרים FAC 8, השיטה הורחבה. לדוגמה, השיטה הוכחה כעובדת עם c-Kit מועשר במח עצם ועם לוחות טעונים במשטח שלילי14. תאימותו עם…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ל-WIMM Flow Cytometry Core על הגישה לציטומטריית זרימה, ול-WIMM Virus Screening Core על יצירת וקטורים לנטיויראליים. עבודה זו מומנה על ידי קרן קיי קנדל ללוקמיה והמועצה הבריטית למחקר רפואי.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
