여기에서는 해마의 시냅스 가소성에 대한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(r-mTBI)의 영향을 조사하기 위해 깨어 있는 폐쇄두부 손상 모델을 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 환자에서 r-mTBI의 중요한 특징을 복제하고 시험관 내 전기생리학과 함께 사용됩니다.
경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)은 북미에서 만연한 건강 문제입니다. 임상 인구에 대한 번역 가능성을 높이기 위해 전임상 환경에서 폐쇄 헤드 mTBI의 생태학적으로 유효한 모델을 활용해야 한다는 압력이 증가하고 있습니다. 깨어 있는 폐쇄 머리 손상(ACHI) 모델은 수정된 제어된 피질 충격기를 사용하여 폐쇄 머리 손상을 전달하여 개두술이나 마취제 사용 없이 임상적으로 관련된 행동 결함을 유도합니다.
이 기술은 일반적으로 사망, 두개골 골절 또는 뇌출혈을 유발하지 않으며 경미한 부상과 더 일치합니다. 실제로 ACHI 절차의 온화한 특성으로 인해 반복적인 mTBI(r-mTBI)를 조사하는 연구에 이상적입니다. r-mTBI가 행동 증상, 신경병리학적 변화 및 신경퇴행을 유발하는 누적 손상을 초래할 수 있다는 증거가 증가하고 있습니다. r-mTBI는 스포츠를 하는 청소년에게 흔하며, 이러한 부상은 강력한 시냅스 재구성 및 수초화 기간 동안 발생하므로 젊은 인구는 특히 r-mTBI의 장기적인 영향에 취약합니다.
또한, r-mTBI는 객관적인 선별 조치가 거의없는 친밀한 파트너 폭력의 경우에 발생합니다. 이 실험에서, 시냅스 기능은 ACHI 모델을 사용하여 r-mTBI를 경험한 어린 쥐의 해마에서 평가되었습니다. 손상 후, 조직 슬라이서를 사용하여 해마 슬라이스를 만들어 r-mTBI 후 1일 또는 7일에 해마의 양방향 시냅스 가소성을 평가했습니다. 전반적으로, ACHI 모델은 연구자들에게 mTBI 및 r-mTBI에 따른 시냅스 가소성의 변화를 연구하기 위해 생태학적으로 유효한 모델을 제공합니다.
외상성 뇌 손상(TBI)은 캐나다와 미국에서 매년 ~200만 건의 사례가 발생하는 심각한 건강 문제입니다 1,2. TBI는 모든 연령대와 성별에 영향을 미치며 유방암, AIDS, 파킨슨병, 다발성 경화증 등 다른 어떤 질병보다 발병률이 높다3. TBI의 유병률에도 불구하고 병태생리학은 잘 이해되지 않고 있으며 치료 옵션은 제한적입니다. 부분적으로, 이것은 모든 TBI의 85%가 경증(mTBI)으로 분류되고, mTBI는 이전에 장기적인 신경정신과적 결과 없이 제한적이고 일시적인 행동 변화만을 일으키는 것으로 생각되었기 때문입니다 4,5. mTBI 회복은 몇 주에서 몇 년이 걸릴 수 있으며5,6 더 심각한 신경학적 상태를 촉발할 수 있으며4, 반복적인 “준충격” 충격도 뇌에 영향을 미친다는 것이 인식되고 있다7. 하키/축구와 같은 스포츠의 선수들은 경기/연습 세션 7,8,9,10당 >10번의 머리 뇌진탕 충격을 받기 때문에 이것은 놀라운 일입니다.
청소년은 mTBI의 발병률이 가장 높으며 캐나다에서는 십대 10명 중 약 1명이 매년 스포츠 관련 뇌진탕으로 치료를 받습니다11,12. 실제로, 뇌진탕 하 두부 충격 또는 mTBI는 뇌에 확산 손상을 일으킬 수 있으며, 이는 또한 후속 부상 및 / 또는 더 심각한 신경 학적 상태 13,14,15,16,17에 대해 더 취약한 상태를 만들 수 있습니다. 캐나다에서는 로완의 법칙을 통해 이전의 손상이 추가 손상에 대한 뇌의 취약성을 증가시킬 수 있다는 것이 법적으로 인정되지만18, r-mTBI에 대한 기계론적 이해는 여전히 비참할 정도로 부적절합니다. 그러나 단일 및 r-mTBI는 학년도 동안 학습 능력에 영향을 미칠 수 있음이 분명합니다 19,20, 성별에 따른 결과 21,22,23,2 4, 그리고 나중에 인지 능력을 손상시킬 수 있습니다16,25,26. 실제로, 코호트 분석은 생애 초기의 r-mTBI를 나중에 치매와 강하게 연관시킵니다27,28. r-mTBI는 또한 잠재적으로 만성 외상성 뇌병증 (CTE)과 관련이 있으며, 이는 과인산화된 타우 단백질의 축적 및 진행성 피질 위축을 특징으로 하고 상당한 염증에 의해 침전된다 27,29,30,31. r-mTBI와 CTE 사이의 연관성은 현재 논란의 여지가 있지만32개, 이 모델을 통해 전임상 환경에서 더 자세히 탐색할 수 있습니다.
mTBI는 닫힌 두개골 내에서 발생하고 현대 영상 기술로도 감지하기 어렵기 때문에 종종 “보이지 않는 손상”으로 설명됩니다33,34. mTBI의 정확한 실험 모델은 두 가지 원칙을 준수해야합니다. 첫째, 임상 집단에서 일반적으로 관찰되는 생체역학적 힘을 요약해야 한다35. 둘째, 모델은 이질적인 행동 결과를 유도해야 하며, 이는 임상 집단에서도 매우 널리 퍼져 있습니다(36,37,38). 현재, 대부분의 전임상 모델은 개두술, 정위 머리 보호, 마취 및 조절된 피질 충격(CCI)을 포함하여 더 심각한 경향이 있으며, 이는 일반적으로 임상적으로 관찰되는 것보다 심각한 구조적 손상과 더 광범위한 행동 결함을 유발한다33. 두개골 절개술과 관련된 뇌진탕의 많은 전임상 모델에 대한 또 다른 우려는 이 절차 자체가 뇌에 염증을 일으키고 이것이 후속 손상으로 인한 mTBI 증상 및 신경병리를 악화시킬 수 있다는 것입니다39,40. 마취는 또한 염증감소 41,42,43, 소교 세포 기능 조절 44, 글루타메이트 방출 45, NMDA 수용체를 통한 Ca2+ 진입 46, 두개 내압 및 뇌 대사 47를 포함하여 몇 가지 복잡한 혼란을 유발합니다. 마취는 혈액뇌장벽(BBB) 투과성, 타우 과인산화 및 코르티코스테로이드 수치를 증가시키는 동시에 인지 기능을 감소시켜 혼란을 더욱 유발합니다 48,49,50,51. 또한, 미만성 폐쇄성 손상은 임상적 mTBI의 대다수를 차지한다52. 또한 성별21, 53세, 부상 간 간격15, 중증도54, 부상 횟수23 등 행동 결과에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인을 더 잘 연구할 수 있다.
가속력/감속력(수직 또는 수평)의 방향도 행동 및 분자 결과에 대한 중요한 고려 사항입니다. Mychasiuk와 동료들의 연구는 확산 폐쇄 머리 mTBI의 두 가지 모델, 즉 체중 낙하 (수직 힘)와 측면 충격 (수평 힘)을 비교했습니다 55. 행동 및 분자 분석 모두 mTBI 후 이질적인 모델 및 성별 의존적 결과를 나타냈다. 따라서, 선형 및 회전력을 통합하면서 수술 절차를 피하는 데 도움이 되는 동물 모델은 이러한 손상이 일반적으로 발생하는 생리학적 조건을 더 잘 나타냅니다33,56. ACHI 모델은 이러한 요구에 부응하여 만들어졌으며, 성별 차이를 편향시키는 것으로 알려진 절차(즉, 마취)를 피하면서 쥐에서 mTBI의 신속하고 재현 가능한 유도를 가능하게 했습니다57.
대부분의 전임상 연구는 임상 모집단에서 볼 수 있는 생체역학적 힘을 요약하지 않는 mTBI 모델을 활용했습니다. 여기서, ACHI 모델이 어린 쥐에서 r-mTBI를 유도하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. r-mTBI의 이 폐쇄형 모델은 보다 침습적인 절차에 비해 상당한 이점이 있습니다. 첫째, ACI는 일반적으로 두개골 골절, 뇌출혈 또는 사망을 일으키지 않으며, 이 모든 것은 임상 집단에서 “경미한” T…
The authors have nothing to disclose.
이 프로토콜의 개발에 기여한 과거와 현재의 빅토리아 대학교 크리스티 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 캐나다 보건 연구소(CIHR: FRN 175042) 및 NSERC(RGPIN-06104-2019)의 자금으로 지원되었습니다. Figure 1 두개골 그래픽은 BioRender로 제작되었습니다.
3D-printed helment | Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) | ||
Agarose | Fisher Scientific (BioReagents) | BP160500 | |
Anesthesia chamber | Home Made | N/A | Plexiglass Container |
Automatic Heater Controller | Warner Electric | TC-324B | |
Axon Digidata | Molecular Devices | 1440A | Low-noise Data Acquisition System |
Balance beam | Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick) | ||
Calcium Chloride | Bio Basic Canada Inc. | CD0050 | For aCSF |
Camera | Dage MTI | NC-70 | |
Carbogen tank | Praxair | MM OXCD5C-K | Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95% |
Clampex Software | Molecular Devices | Clampex 10.5 Version | |
Compresstome Vibrating Microtome | Precisionary | VF 310-0Z | |
Concentric Bipolar Electrode | FHC Inc. | CBAPC75 | |
Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific (Chemical) | D16-3 | aCSF |
Digital Stimulus Isolation Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 4D | |
Disodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S373-500 | PBS |
Dissection Tools | |||
Feather Double Edge Blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-10 | |
Filter Paper | Whatman 1 | 1001-055 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
Hair Claw Clip | Can be obtained from any department store | ||
Home and Recovery Cages | Normal rat cages from animal care unit. | ||
Hum Bug Noise Eliminator | Quest Scientific | 726300 | |
Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
Isotemp 215 Digital Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-15 | |
Leica Impact One CCI unit | Leica Biosystems | Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip | |
Long-Evans rats, male | Charles River Laboratories (St. Constant, PQ) | ||
Low-Density Foam Pad | 3" polyurethane foam sheet | ||
Magnesium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | M33-500 | aCSF |
Male Long Evans Rats | Charles River Laboratories | Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria | |
MultiClamp 700B Amplifier | Molecular Devices | Model 700B | |
pH Test Strips | VWR Chemicals BDH | BDH83931.601 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | P217-500 | aCSF, PBS |
Potassium Phosphate | Sigma | P9791-500G | PBS |
Push Button Controller | Siskiyou Corporation | MC1000e | Four-axis Closed Loop Controller Push-Button |
Sample Discs | ELITechGroup | SS-033 | For use with Vapor Pressure Osmometer |
Small towel | |||
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific (Chemical) | S233-500 | aCSF |
Sodium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | S271-3 | For aCSF, PBS |
Sodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S369-500 | aCSF |
Soft Plastic Restraint Cones | Braintree Scientific | model DC-200 | |
Stopwatch | Many lab members use their iPhone for this | ||
Table or large cart with raised edges | For NAP and ACHI | ||
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) | Sutter Instrument | BF150-110-10 | Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm |
Upright Microscope | Olympus | Olympus BX5OWI | 5x MPlan 0.10 NA Objective lens |
Vapor Pressure Osmometer | Vapro | Model 5600 | aCSF should be 300-310 mOSM |
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
Vibraplane Vibration Isolation Table | Kinetic Systems | 9101-01-45 |