Hier wordt gedemonstreerd hoe een wakker gesloten-hoofdletselmodel kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van herhaald licht traumatisch hersenletsel (r-mTBI) op synaptische plasticiteit in de hippocampus. Het model repliceert belangrijke kenmerken van r-mTBI bij patiënten en wordt gebruikt in combinatie met in vitro elektrofysiologie.
Mild traumatisch hersenletsel (mTBI’s) zijn een veel voorkomend gezondheidsprobleem in Noord-Amerika. Er is een toenemende druk om ecologisch geldige modellen van gesloten mTBI in de preklinische setting te gebruiken om de vertaalbaarheid naar de klinische populatie te vergroten. Het awake closed-headed injury (ACHI) model maakt gebruik van een gemodificeerde gecontroleerde corticale impactor om geslotenhoofdig letsel te leveren, waardoor klinisch relevante gedragsstoornissen worden geïnduceerd zonder de noodzaak van een craniotomie of het gebruik van een verdovingsmiddel.
Deze techniek veroorzaakt normaal gesproken geen dodelijke slachtoffers, schedelbreuken of hersenbloedingen en is meer consistent met een milde verwonding. Inderdaad, de milde aard van de ACHI-procedure maakt het ideaal voor studies die repetitieve mTBI (r-mTBI) onderzoeken. Groeiend bewijs geeft aan dat r-mTBI kan resulteren in een cumulatief letsel dat gedragssymptomen, neuropathologische veranderingen en neurodegeneratie veroorzaakt. r-mTBI komt vaak voor bij sportende jongeren en deze blessures treden op tijdens een periode van robuuste synaptische reorganisatie en myelinisatie, waardoor de jongere bevolking bijzonder kwetsbaar is voor de langetermijninvloeden van r-mTBI.
Verder komt r-mTBI voor in gevallen van intiem partnergeweld, een aandoening waarvoor weinig objectieve screeningsmaatregelen bestaan. In deze experimenten werd de synaptische functie beoordeeld in de hippocampus bij juveniele ratten die r-mTBI hadden ervaren met behulp van het ACHI-model. Na de verwondingen werd een weefselsnijder gebruikt om hippocampale plakjes te maken om bidirectionele synaptische plasticiteit in de hippocampus te evalueren op 1 of 7 dagen na de r-mTBI. Over het algemeen biedt het ACHI-model onderzoekers een ecologisch geldig model om veranderingen in synaptische plasticiteit na mTBI en r-mTBI te bestuderen.
Traumatisch hersenletsel (TBI) is een belangrijk gezondheidsprobleem, met ~ 2 miljoen gevallen in Canada en de Verenigde Staten elk jaar 1,2. TBI treft alle leeftijdsgroepen en geslachten en heeft een incidentie die groter is dan die van welke andere ziekte dan ook, met name borstkanker, aids, de ziekte van Parkinson en multiple sclerose3. Ondanks de prevalentie van TBI blijft de pathofysiologie slecht begrepen en zijn de behandelingsopties beperkt. Voor een deel komt dit omdat 85% van alle TBI’s zijn geclassificeerd als mild (mTBI), en mTBI is eerder gedacht dat het slechts beperkte en voorbijgaande gedragsveranderingen veroorzaakt zonder neuropsychiatrische gevolgen op lange termijn 4,5. Het wordt nu erkend dat mTBI-herstel weken tot jaren5,6 kan duren, ernstigere neurologische aandoeningen kan bespoedigen4, en dat zelfs herhaalde “sub-hersenschudding” -effecten de hersenen beïnvloeden7. Dit is alarmerend omdat atleten in sporten zoals hockey / voetbal >10 hoofdsub-hersenschudding hebben per wedstrijd / oefensessie 7,8,9,10.
Adolescenten hebben de hoogste incidentie van mTBI en in Canada zal ongeveer één op de 10 tieners jaarlijks medische zorg zoeken voor een sportgerelateerde hersenschudding11,12. In werkelijkheid kan elke sub-hersenschudding of mTBI diffuse schade aan de hersenen veroorzaken, en dit kan ook een meer kwetsbare toestand creëren voor latere verwondingen en / of ernstigere neurologische aandoeningen 13,14,15,16,17. In Canada wordt wettelijk erkend via de wet van Rowan dat eerder letsel de kwetsbaarheid van de hersenen voor verder letsel kan vergroten18, maar het mechanistische begrip van r-mTBI blijft jammerlijk ontoereikend. Het is echter duidelijk dat single en r-mTBI het leervermogen tijdens schooljaren19,20 kunnen beïnvloeden, geslachtsspecifieke uitkomsten 21,22,23,2 4 kunnen hebben en de cognitieve capaciteit later in het leven kunnen aantasten16,25,26. Inderdaad, cohortanalyses associëren r-mTBI vroeg in het leven sterk met dementie later op27,28. r-mTBI is ook potentieel geassocieerd met chronische traumatische encefalopathie (CTE), die wordt gekenmerkt door de accumulatie van hyperfosforyleerd tau-eiwit en progressieve corticale atrofie en versneld door significante ontsteking 27,29,30,31. Hoewel de verbanden tussen r-mTBI en CTE momenteel controversieel zijn32, zal dit model het mogelijk maken om ze in een preklinische setting in meer detail te onderzoeken.
Een mTBI wordt vaak beschreven als een “onzichtbare verwonding”, omdat het optreedt in een gesloten schedel en moeilijk te detecteren is, zelfs met moderne beeldvormingstechnieken33,34. Een nauwkeurig experimenteel model van mTBI moet zich houden aan twee principes. Ten eerste moet het de biomechanische krachten samenvatten die normaal worden waargenomen in de klinische populatie35. Ten tweede moet het model heterogene gedragsuitkomsten induceren, iets dat ook veel voorkomt in klinische populaties36,37,38. Momenteel zijn de meeste preklinische modellen ernstiger, met craniotomie, stereotaxische hoofdsteun, anesthesie en gecontroleerde corticale effecten (CCI) die aanzienlijke structurele schade en uitgebreidere gedragsstoornissen veroorzaken dan normaal klinisch wordt waargenomen33. Een andere zorg bij veel preklinische modellen van hersenschudding waarbij craniotomieën betrokken zijn, is dat deze procedure zelf ontstekingen in de hersenen veroorzaakt, en dit kan mTBI-symptomen en neuropathologie verergeren van elk volgend letsel39,40. Anesthesie introduceert ook verschillende complexe confounds, waaronder het verminderen van ontsteking 41,42,43, modulerende microgliale functie44, glutamaatafgifte 45, Ca2+ toegang via NMDA-receptoren 46, intracraniale druk en cerebraal metabolisme 47. Anesthesie introduceert verder confounds door het verhogen van de bloed-hersenbarrière (BBB) permeabiliteit, tau-hyperfosforylering en corticosteroïde niveaus, terwijl de cognitieve functie wordt verminderd 48,49,50,51. Bovendien vertegenwoordigen diffuse, geslotenhoofdige letsels de overgrote meerderheid van de klinische mTBI’s52. Ze stellen iemand ook in staat om de veelheid aan factoren die gedragsuitkomsten kunnen beïnvloeden beter te bestuderen, waaronder geslacht21, leeftijd 53, inter-letsel-interval15, ernst54 en het aantal verwondingen23.
De richting van de acceleratieve/vertragende krachten (verticaal of horizontaal) is ook een belangrijke overweging voor gedrags- en moleculaire uitkomsten. Onderzoek van Mychasiuk en collega’s hebben twee modellen van diffuse gesloten mTBI vergeleken: gewichtsval (verticale krachten) en laterale impact (horizontale krachten)55. Zowel de gedrags- als de moleculaire analyses onthulden heterogene model- en geslachtsafhankelijke uitkomsten na mTBI. Diermodellen die chirurgische ingrepen helpen vermijden, terwijl ze lineaire en rotatiekrachten bevatten, zijn dus meer representatief voor de fysiologische omstandigheden waaronder deze verwondingen normaal optreden33,56. Het ACHI-model is gemaakt als reactie op deze behoefte, waardoor de snelle en reproduceerbare inductie van mTBI bij ratten mogelijk is, terwijl procedures (d.w.z. anesthesie) worden vermeden waarvan bekend is dat ze geslachtsverschillen vertekenen57.
Het meeste preklinische onderzoek heeft modellen van mTBI gebruikt die de biomechanische krachten in de klinische populatie niet samenvatten. Hier wordt getoond hoe het ACHI-model kan worden gebruikt om r-mTBI’s te induceren bij juveniele ratten. Dit gesloten model van r-mTBI heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van meer invasieve procedures. Ten eerste veroorzaakt de ACHI normaal gesproken geen schedelfracturen, hersenbloedingen of sterfgevallen, die allemaal contra-indicaties zouden zijn van een “milde” TBI in kli…
The authors have nothing to disclose.
We danken alle leden van het Christie Laboratory aan de Universiteit van Victoria, vroeger en nu, voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol. Dit project werd ondersteund met fondsen van de Canadian Institutes for Health Research (CIHR: FRN 175042) en NSERC (RGPIN-06104-2019). De figuur 1 schedelafbeelding is gemaakt met BioRender.
3D-printed helment | Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) | ||
Agarose | Fisher Scientific (BioReagents) | BP160500 | |
Anesthesia chamber | Home Made | N/A | Plexiglass Container |
Automatic Heater Controller | Warner Electric | TC-324B | |
Axon Digidata | Molecular Devices | 1440A | Low-noise Data Acquisition System |
Balance beam | Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick) | ||
Calcium Chloride | Bio Basic Canada Inc. | CD0050 | For aCSF |
Camera | Dage MTI | NC-70 | |
Carbogen tank | Praxair | MM OXCD5C-K | Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95% |
Clampex Software | Molecular Devices | Clampex 10.5 Version | |
Compresstome Vibrating Microtome | Precisionary | VF 310-0Z | |
Concentric Bipolar Electrode | FHC Inc. | CBAPC75 | |
Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific (Chemical) | D16-3 | aCSF |
Digital Stimulus Isolation Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 4D | |
Disodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S373-500 | PBS |
Dissection Tools | |||
Feather Double Edge Blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-10 | |
Filter Paper | Whatman 1 | 1001-055 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
Hair Claw Clip | Can be obtained from any department store | ||
Home and Recovery Cages | Normal rat cages from animal care unit. | ||
Hum Bug Noise Eliminator | Quest Scientific | 726300 | |
Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
Isotemp 215 Digital Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-15 | |
Leica Impact One CCI unit | Leica Biosystems | Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip | |
Long-Evans rats, male | Charles River Laboratories (St. Constant, PQ) | ||
Low-Density Foam Pad | 3" polyurethane foam sheet | ||
Magnesium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | M33-500 | aCSF |
Male Long Evans Rats | Charles River Laboratories | Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria | |
MultiClamp 700B Amplifier | Molecular Devices | Model 700B | |
pH Test Strips | VWR Chemicals BDH | BDH83931.601 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | P217-500 | aCSF, PBS |
Potassium Phosphate | Sigma | P9791-500G | PBS |
Push Button Controller | Siskiyou Corporation | MC1000e | Four-axis Closed Loop Controller Push-Button |
Sample Discs | ELITechGroup | SS-033 | For use with Vapor Pressure Osmometer |
Small towel | |||
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific (Chemical) | S233-500 | aCSF |
Sodium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | S271-3 | For aCSF, PBS |
Sodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S369-500 | aCSF |
Soft Plastic Restraint Cones | Braintree Scientific | model DC-200 | |
Stopwatch | Many lab members use their iPhone for this | ||
Table or large cart with raised edges | For NAP and ACHI | ||
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) | Sutter Instrument | BF150-110-10 | Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm |
Upright Microscope | Olympus | Olympus BX5OWI | 5x MPlan 0.10 NA Objective lens |
Vapor Pressure Osmometer | Vapro | Model 5600 | aCSF should be 300-310 mOSM |
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
Vibraplane Vibration Isolation Table | Kinetic Systems | 9101-01-45 |