Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi
Summary
Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.
Abstract
Dokudan türetilen küçük hücre dışı veziküller (sEV’ler), kaynak hücrelerin fonksiyonel durumunu ve dokunun interstisyel boşluğunun özelliklerini yansıtabilir. Bu sEV’lerin verimli bir şekilde zenginleştirilmesi, biyolojik işlevlerinin incelenmesi için önemli bir önkoşuldur ve klinik tespit tekniklerinin ve terapötik taşıyıcı teknolojisinin geliştirilmesinin anahtarıdır. SEV’leri dokudan izole etmek zordur, çünkü genellikle ağır kirlenirler. Bu çalışma, karaciğer kanseri dokusundan yüksek kaliteli sEV’lerin hızlı bir şekilde zenginleştirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem dört aşamalı bir işlem içerir: sindirim enzimlerinin (kollajenaz D ve DNaz Ι) doku ile inkübasyonu, 70 μm hücre süzgecinden filtrasyon, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm membran filtresi ile filtrasyon. Diferansiyel ultrasantrifüjleme adımının optimizasyonu ve bir filtreleme adımının eklenmesi sayesinde, bu yöntemle elde edilen sEV’lerin saflığı, klasik diferansiyel ultrasantrifüjleme ile elde edilenden daha yüksektir. Doku kaynaklı sEV’lerin incelenmesi için önemli bir metodoloji ve destekleyici veriler sağlar.
Introduction
Küçük hücre dışı veziküller (sEV’ler) yaklaşık 30 nm ila 150 nm çapındadır ve çeşitli hücreler tarafından salgılanır1. Doku hücreleri ile iletişim kurabilir ve lipitler, proteinler, DNA ve RNA gibi önemli biyolojik molekülleri çeşitli organlara, dokulara, hücrelere ve hücre içi parçalara taşıyarak yerel veya uzak mikro ortamı düzenleyebilirler. Böylece, alıcı hücrelerin davranışını da değiştirebilirler 2,3. Belirli sEV’lerin izolasyonu ve saflaştırılması, hastalığın gelişimi ve seyri sırasında biyolojik davranışlarını incelemek için gerekli bir ön koşuldur. Altın standart olarak kabul edilen diferansiyel ultrasantrifüjleme, sEV’leri normalde bulundukları dokulardan ayırmak için yaygın olarak kullanılır4. Doku kalıntıları, hücre kalıntıları, büyük veziküller ve apoptotik cisimler bu teknikle çıkarılabilir ve sadece sEV’ler bırakılabilir.
Kollajenaz D ve DNaz I’in, hücrelerin veya veziküllerin moleküler özelliklerini etkilemediği, her iki enzimin özelliklerinin hücre dışı matris 5’teki veziküllerin salınımına katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Bu enzimler, insan metastatik melanom dokusundan, kolon kanseri dokusundan ve kolonik mukozal dokudan sEV’leri çıkarmak için kullanılmıştır 5,6,7. Bununla birlikte, bu yöntemlerde kollajenaz D ve DNaz I’in konsantrasyonu ve sindirim süresi farklılık göstermekte ve tutarsız sonuçlara yol açmaktadır. Diğer sEV alt tiplerinin kopyalanmasını önlemek için, araştırmacılar filtrasyon ve / veya diferansiyel santrifüjleme8 ile daha büyük hücre dışı vezikülleri (0.1 μm veya 0.2 μm çapında) çıkardılar. Kaynak dokuya bağlı olarak, farklı izolasyon ve saflaştırma yöntemleri gerekebilir 9,10.
Karaciğer dokusundan sEV’leri çıkarmak için geleneksel diferansiyel ultrasantrifüjleme yönteminin kullanılması, özelliklerini belirlemenin herhangi bir yolu olmadan, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası ile sonuçlanır. Önceki bir çalışmada11, bu beyaz madde tabakasının sEV’lerin saflığını etkilediği bulunmuştur. Geleneksel yöntemle izole edilen numunelerin partikül sayısı ve protein konsantrasyonu mevcut yöntemden daha yüksek olmasına rağmen, varyasyon katsayısı büyüktü, çünkü muhtemelen birçok kirletici sonuçların zayıf tekrarlanabilirliğine yol açabilir. Yani, deterjan kullanarak (yani,% 1 Triton X-100’deki parçacıkların çözünürlüğünü tespit ederek), bu yöntemle elde edilen sEV’lerin saflığının daha büyük olduğunu bulduk. Bu nedenle, proteomik araştırmalar için kolorektal kanser dokusundan türetilen sEV’leri izole etmek ve saflaştırmak için bu yöntemi kullanıyoruz.
Şu anda, karaciğer kanserinde sEV’ler üzerine yapılan araştırmalar esas olarak serum, plazma ve hücre kültürünün süpernatantı12,13,14’e odaklanmıştır. Bununla birlikte, karaciğer kanseri dokusundan türetilen sEV’ler, fizyolojik patolojiyi ve karaciğer kanserinin çevresindeki mikro ortamı daha doğru bir şekilde yansıtabilir ve diğer EV’lerin bozulmasını ve kirlenmesini etkili bir şekilde önleyebilir15,16. Diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanımı ile, bu yöntem verimi zenginleştirebilir ve yüksek kaliteli sEV’ler elde edebilir ve karaciğer kanserinin daha ileri çalışmaları için önemli bir temel sağlar. Bu yöntem, karaciğer kanseri dokusunun keskin bir ayırma ile ayrılmasını ve kollajenaz D ve DNaz I ile ayrışmasını sağlar. Daha sonra, hücresel enkaz, büyük veziküller ve apoptotik cisimler filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile daha da uzaklaştırılır. Son olarak, sEV’ler daha sonraki çalışmalar için izole edilir ve saflaştırılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, karaciğer kanseri dokusundan sEV’leri çıkarmak için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar. Yüksek kaliteli sEV’ler keskin doku izolasyonu, sindirim enzimleri ile tedavi, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm filtre membranı filtrasyonu ve saflaştırılması ile elde edilir. Aşağı akış analizi için, sEV’lerin yüksek saflığını sağlamak son derece önemlidir. Diferansiyel santrifüjleme sürecinde, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası (bilinmeyen bileşim) görünecekti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi’ne bu çalışmayı destekledikleri için teşekkür eder. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe numaraları 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
