Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe
Summary
Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.
Abstract
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die aus Gewebe gewonnen werden, können den funktionellen Status der Quellzellen und die Eigenschaften des interstitiellen Raums des Gewebes widerspiegeln. Die effiziente Anreicherung dieser sEVs ist eine wichtige Voraussetzung für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion und ein Schlüssel für die Entwicklung klinischer Nachweistechniken und therapeutischer Trägertechnologien. Es ist schwierig, sEVs aus Gewebe zu isolieren, da sie in der Regel stark kontaminiert sind. Diese Studie liefert eine Methode zur schnellen Anreicherung von hochwertigen sEVs aus Leberkrebsgewebe. Das Verfahren umfasst einen vierstufigen Prozess: die Inkubation von Verdauungsenzymen (Kollagenase D und DNase Ι) mit Gewebe, die Filtration durch ein 70-μm-Zellsieb, die differentielle Ultrazentrifugation und die Filtration durch einen 0,22-μm-Membranfilter. Aufgrund der Optimierung des differentiellen Ultrazentrifugationsschritts und der Hinzufügung eines Filtrationsschritts ist die Reinheit der mit diesem Verfahren erhaltenen sEVs höher als diejenige, die durch die klassische differentielle Ultrazentrifugation erreicht wird. Es liefert eine wichtige Methodik und unterstützende Daten für die Untersuchung von aus Gewebe gewonnenen sEVs.
Introduction
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) haben einen Durchmesser von etwa 30 nm bis 150 nm und werden von verschiedenen Zellensezerniert 1. Sie können mit Gewebezellen kommunizieren und die lokale oder entfernte Mikroumgebung regulieren, indem sie wichtige biologische Moleküle wie Lipide, Proteine, DNA und RNA zu verschiedenen Organen, Geweben, Zellen und intrazellulären Teilen transportieren. Somit können sie auch das Verhalten von Empfängerzellen 2,3 verändern. Die Isolierung und Aufreinigung spezifischer sEVs ist eine wesentliche Voraussetzung, um ihr biologisches Verhalten während der Entstehung und des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Die differentielle Ultrazentrifugation, die als Goldstandard gilt, wird häufig verwendet, um sEVs von den Geweben zu trennen, in denen sie sich normalerweise befinden4. Gewebetrümmer, Zelltrümmer, große Vesikel und apoptotische Körper können mit dieser Technik entfernt werden, so dass nur die sEVs übrig bleiben.
Es wurde gezeigt, dass Kollagenase D und DNase I die molekularen Eigenschaften von Zellen oder Vesikeln nicht beeinflussen, wobei die Eigenschaften beider Enzyme zur Freisetzung von Vesikeln in der extrazellulären Matrix beitragen 5. Diese Enzyme wurden verwendet, um sEVs aus menschlichem metastasiertem Melanomgewebe, Darmkrebsgewebe und Dickdarmschleimhautgewebe zu extrahieren 5,6,7. Die Konzentration und Verdauungszeit von Kollagenase D und DNase I in diesen Methoden unterscheiden sich jedoch, was zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen führt. Um die Kopräzipitation anderer Subtypen von sEVs zu vermeiden, haben Forscher größere extrazelluläre Vesikel (0,1 μm oder 0,2 μm Durchmesser) durch Filtration und/oder differentielle Zentrifugation entfernt8. Je nach Ausgangsgewebe können unterschiedliche Methoden der Isolierung und Reinigung erforderlich sein 9,10.
Die Verwendung der traditionellen differentiellen Ultrazentrifugationsmethode zur Extraktion von sEVs aus Lebergewebe führt zu einer Schicht weißer Substanz auf der Oberfläche des Überstandes, ohne dass seine Eigenschaften bestimmt werden können. In einer früheren Studie11 wurde festgestellt, dass diese Schicht der weißen Substanz die Reinheit der sEVs beeinflusst. Obwohl die Partikelanzahl und die Proteinkonzentration der mit der traditionellen Methode isolierten Proben höher waren als die der aktuellen Methode, war der Variationskoeffizient groß, möglicherweise weil viele Schadstoffe zu einer schlechten Wiederholbarkeit der Ergebnisse führen können. Das heißt, unter Verwendung von Detergens (d.h. Nachweis der Löslichkeit von Partikeln in 1% Triton X-100) stellten wir fest, dass die Reinheit der mit dieser Methode erhaltenen sEVs größer war. Daher verwenden wir diese Methode, um sEVs aus Darmkrebsgewebe für die Proteomforschung zu isolieren und zu reinigen.
Gegenwärtig konzentriert sich die Forschung zu sEVs bei Leberkrebs hauptsächlich auf Serum, Plasma und den Überstand der Zellkultur12,13,14. Aus Leberkrebsgewebe gewonnene sEVs können jedoch die physiologische Pathologie und die umgebende Mikroumgebung von Leberkrebs genauer widerspiegeln und den Abbau und die Verschmutzung anderer EVs wirksam verhindern15,16. Durch den Einsatz der differentiellen Ultrazentrifugation kann diese Methode die Ausbeute anreichern und qualitativ hochwertige sEVs erhalten, was eine wichtige Grundlage für die weitere Untersuchung von Leberkrebs darstellt. Diese Methode ermöglicht es, das Leberkrebsgewebe durch scharfe Trennung zu trennen und durch Kollagenase D und DNase I zu dissoziieren. Dann werden die zellulären Trümmer, großen Vesikel und apoptotischen Körper durch Filtration und differentielle Ultrazentrifugation weiter entfernt. Schließlich werden die sEVs isoliert und für spätere Studien gereinigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine wiederholbare Methode zur Extraktion von sEVs aus Leberkrebsgewebe. Hochwertige sEVs werden durch scharfe Gewebeisolierung, Behandlung mit Verdauungsenzymen, differentielle Ultrazentrifugation und 0,22-μm-Filtermembranfiltration und -reinigung erhalten. Für die nachgeschaltete Analyse ist es äußerst wichtig, die hohe Reinheit der sEVs sicherzustellen. Bei der differentiellen Zentrifugation erscheint eine Schicht weißer Substanzen (unbekannte Zusammensetzung) auf der Oberfläche des ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem First Affiliated Hospital der Gannan Medical University für die Unterstützung dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Fördernummern 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
