롤링 서클 강화 효소 활성 검출 검정을 이용한 토포이소머라제 1 활성의 민감성 및 정량적 검출을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 이 방법은 정제된 성분 또는 세포/조직 추출물로부터 토포이소머라제 1 활성의 검출을 허용한다. 이 프로토콜은 효소 활성의 검출과 관련된 모든 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.
롤링 서클 증폭과 같은 등온 증폭 기반 기술은 핵산, 단백질 양 또는 기타 관련 분자의 검출에 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 방법은 임상 및 연구 응용 분야에서 PCR 또는 ELISA에 대한 실질적인 대안으로 나타났습니다. 더욱이, 단백질 양의 검출 (웨스턴 블롯 또는 면역 조직 화학에 의한)은 종종 암 진단을위한 정보를 제공하기에 불충분 한 반면, 효소 활성의 측정은 가치있는 바이오 마커를 나타낸다. 효소 활성의 측정은 또한 병원체 매개 질병의 진단 및 잠재적 치료를 허용합니다. 모든 진핵생물에서 토포이소머라제는 중요한 세포 과정에서 DNA 토폴로지 상태의 조절에 관여하는 핵심 DNA 결합 효소이며 암 예후 및 치료를 위한 중요한 바이오마커 중 하나입니다.
수년에 걸쳐, 토포이소머라제는 매년 조사되는 천연 및 합성 소분자 화합물의 라이브러리를 통해 구충제 및 항암제의 잠재적 표적으로 실질적으로 조사되었습니다. 여기서, 간단하고 빠르며 겔이 없는 방식으로 토포이소머라제 1(TOP1) 활성의 정량적 측정을 허용하는 롤링 서클 강화 효소 활성 검출(REEAD) 분석이라고 하는 롤링 서클 증폭 방법이 제시됩니다. TOP1은 특별히 설계된 DNA 기질을 절단하고 결찰함으로써 DNA 올리고뉴클레오티드를 닫힌 원으로 변환하여 롤링 서클 증폭을 위한 주형이 되어 ~10~103 직렬 반복 롤링 서클 생성물을 생성합니다. 증폭 중 뉴클레오티드 혼입에 따라 형광에서 화학 발광, 비색에 이르기까지 다양한 판독 방법의 가능성이 있습니다. 각 TOP1 매개 절단 결찰은 하나의 폐쇄 DNA 원을 생성하므로 분석은 매우 민감하고 직접 정량적입니다.
토포이소머라제는 DNA 변형 효소 부류에 속하며 이들 중 다수는 인간 질병 1,2,3,4,5,6에 대한 바이오마커로 유용한 것으로 입증되었습니다. TOP1은 DNA 복제, 유전자 전사, 재조합 및 염색체 분리와 같은 세포 과정과 관련된 토폴로지 스트레스를 해결하는데 관여한다7. TOP1은 DNA 8,9에서 일시적인 단일 가닥 절단의 형성을 포함하는 메커니즘에 의해 음극 및 양성 슈퍼 코일을 모두 해결할 수 있습니다. DNA에 결합한 후 TOP1은 활성 부위 티로신(Tyr723)을 위치시켜 포스포디에스테르 골격에 친핵성 공격을 수행합니다. 그런 다음 끊어진 DNA 가닥의 3′-말단에 공유 결합된 효소로 TOP1-DNA 절단 복합체가 생성됩니다. 이것은 절단된 가닥의 5′ 끝이 손상되지 않은 가닥 주위를 회전하도록 하여 비틀림 응력을 해제합니다. 마지막으로, 5′-말단의 히드록실기는 3′-포스포티로실 결합에 대해 친핵성 공격을 수행한다. 그 결과, TOP1이 방출되고, DNA 백본이 복원된다(8).
이완 분석(10), 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)11,12, DNA 자살 절단-결찰 분석(13,14) 및 생체내 효소 복합체(ICE) 분석(15)을 포함하여 TOP1 촉매 주기의 단계를 조사하기 위한 여러 분석이 개발되었습니다. . 그러나 이러한 분석은 DNA 삽입제가 필요한 겔 전기영동에 의존하거나 고도로 전문화된 교육 및 장비가 필요하기 때문에 몇 가지 한계가 있습니다. 더욱이, 분석에는 다량의 정제된 TOP1 효소(이완 분석의 경우 1 내지 5 ng, EMSA 및 절단-결찰 분석의 경우 50 내지 200 ng 범위) 또는 적어도 106 세포로부터의 추출물이 최적으로 수행되어야 한다. 따라서, 미정제 생물학적 샘플에서 TOP1 활성의 특이적 검출을 가능하게 하는 및 단일 촉매 이벤트 레벨에서, REEAD 분석이라고 하는 매우 민감한 방법이 개발되었다(16).
여기서, REEAD 분석법16 을 이용한 TOP1 활성의 검출을 위한 프로토콜이 제시된다. 분석의 개략적인 표현이 그림 1에 나와 있습니다. 맞춤 설계된 실리콘 그리드가 기능화된 슬라이드에 부착되어 유리 슬라이드 멀티웰 설정을 생성하며, 다음 페이지에서는 wellmaker라고 합니다(그림 1A). 이어서 5′-아미노 변형된 프라이머를 슬라이드의 웰 내의 기능성 NHS 그룹에 커플링한다(도 1B). TOP1 매개 절단 및 결찰 반응은 특정 DNA 기질을 닫힌 원으로 변환합니다. TOP1 특정 기판(그림 1C)은 이중 가닥 스템과 2개의 단일 가닥 루프를 포함하는 덤벨 모양으로 자발적으로 접힙니다. 루프 중 하나는 표면 고정 프라이머를 보완합니다. 줄기 영역은 3′-말단 및 5′-히드록실 오버행으로부터 상류에 유리한 TOP1 절단 부위 3개의 염기를 함유한다. 기질의 순환화는 세포/조직 추출물(그림 1C) 또는 재조합 정제 TOP1(그림 1D)을 사용하여 달성할 수 있습니다.
기질이 TOP1에 의해 절단되면 효소는 3′-말단에 일시적으로 결합되고 3-염기 단편이 확산되어 5′-오버행이 기질에 어닐링되고 TOP1-매개 결찰을 촉진합니다. 결찰은 기질의 순환을 초래하고 이어서 TOP1의 해리를 초래합니다. 닫힌 원은 표면 고정 프라이머 (그림 1E)에 혼성화되고 ph29 중합 효소에 의해 매개되는 등온 롤링 원 증폭 (RCA)을위한 템플릿으로 사용되며, 이는 가닥 변위로 RCA를 수행하여 10개의 3 직렬 반복 생성물을 생성 할 수 있습니다. RCA 단계 동안, 형광 표지 (도 1F) 또는 비오틴 결합 (도 1G) 뉴클레오티드가 혼입될 수 있다(17). 형광 표지된 뉴클레오티드의 통합은 형광 현미경 또는 형광 스캐너를 사용하여 RCP를 검출할 수 있습니다. 대안적으로, 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 결합 항 비오틴 항체 (그림 1H)는 비오틴 화 된 뉴클레오티드에 결합 할 수 있으므로 강화 된 화학 발광 (ECL)을 사용하거나 3,3′,5,5′- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)을 검출 가능한 색상으로 전환시킴으로써 압연 된 원형 생성물 (RCP)을 검출 할 수 있습니다. RCA는 선형 반응 동역학을 따르며, 하나의 RCP가 단일 TOP1 매개 절단 결찰 반응을 나타내기 때문에 REEAD 분석을 직접 정량화합니다. 여기에서 이 분석은 정제된 재조합 효소로서 또는 원유 샘플에서 추출된 TOP1 활성을 검출하고 항-TOP1 약물 스크리닝 도구로 사용할 수 있음을 보여줍니다.
토포이소머라제는 높은 연구 및 임상적 관심을 끄는 DNA 변형 효소 계열을 나타내며 항암 치료 또는 전염병 퇴치에 잠재적인 효과가 있는 소분자 화합물의 표적입니다. 더욱이, 인간 TOP1의 활성은 암 예후 및 치료18,19,23의 효과적인 바이오마커인 것으로 입증되었다. 화학요법 억제제(26)의 효능에 영향을 미치는 것은 TOP1 활성이지만, 임상 환경에서 평가되는 것은 종종 DNA-RNA의 양 또는 TOP1의 양이다. 이는 모든 실험실 환경에서 토포이소머라제 활성의 정확하고 정밀한 정량화를 제공할 수 있는 빠르고 쉬운 젤 기반 유리 도구가 없기 때문입니다.
여기서, 겔 무함유 방식으로 TOP1 활성의 측정을 허용하는 REEAD 분석을 위한 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜에서 정제된 TOP1 또는 세포로부터의 조 추출물은 TOP1에 의해 매개되는 절단/결찰 시 폐쇄된 원형 분자로 전환되는 특별히 설계된 DNA 덤벨 모양의 기질과 함께 배양됩니다. 그런 다음 원은 유리 표면에 혼성화되고 RCA에 의해 증폭됩니다. 슬라이드에서 일어나는 반응을 쉽게 수행 할 수 있도록 실리콘 그리드가 유리에 부착되어 반응이 일어나는 개별 웰을 만듭니다. 이러한 방식으로 프로토콜은 웰메이커라고 하는 멀티웰 시스템(실리콘 그리드)을 활용합니다.
상기 프로토콜은 일례로서 사용된 결장직장 선암 세포 Caco2로부터 추출된 재조합 TOP1 및 TOP1의 활성을 검출하기 위해 사용되었다. 더욱이, 약물 스크리닝 도구로서 사용되는 REEAD의 예로서, 상기 프로토콜은 잘 알려진 TOP1 억제제 CPT24,25에 의한 TOP1 활성 억제를 검출하기 위해 사용되었다. 이 분석은 높은 감도를 제공하는 형광 현미경과 덜 전문화된 장비와 교육이 필요한 형광 스캐너, 화학발광 또는 비색계와 같은 다양한 판독 방법과 결합되었습니다. 고감도 형광 현미경 판독은 양질의 형광 현미경 설정, 숙련된 인력, 시간 소모적인 이미지 획득 및 분석이 필요하다는 한계가 있습니다.
이러한 이유로, 감도를 희생하더라도 더 빠른 획득 및 분석을 가능하게 하는 형광 스캐너 판독값이 제시된다. 형광 스캐너가 없는 경우 화학발광 및 비색 판독 방법이라는 두 가지 우수한 대안을 고려할 수 있습니다. 두 방법 모두 빠르고 간단하며 값 비싼 장비 나 전문 교육이 필요하지 않습니다. 모든 판독 형식에서 REEAD는 시간이 더 많이 걸리고 겔 기반(삽입제의 요구 사항이 있음)이며 덜 직접적인 정량적인 최첨단 분석에 비해 많은 장점이 있습니다. 그러나 제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 약물 스크리닝을 처리할 때 시점, 약물 농도 및 TOP1 양/DNA 기질의 비율은 CPT에 최적화된 설명된 설정과 비교하여 최적화되어야 합니다. 약물은 DNA 기질을 사용한 예비배양 또는 TOP1 효소를 이용한 예비배양을 수행하는 것을 조사할 수 있다. 이것은 분자가 TOP1을 억제하는 능력에 대한 귀중한 정보를 제공하고 약물 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
또한, 신호가 낮거나 없는 경우, 이는 원유 샘플의 비효율적인 용해 또는 프로테아제 억제제의 부적절한 사용으로 인한 추출물의 TOP1 분해 때문일 가능성이 큽니다. 또한, 이는 또한 재조합 TOP1, phi29 중합효소, 뉴클레오티드, 기질 및 프라이머와 같은 중요한 분석 성분의 부적절한 저장 때문일 수 있다. 마지막으로, 올리고뉴클레오티드의 반복적인 동결-해동 주기는 피해야 하는데, 이는 분석 성능에 극적인 영향을 미치기 때문입니다. 조추출물을 사용하는 경우 특정 생물학적 샘플의 추출 효율을 최적화해야 하며 TOP1의 양과 활성은 여기에 보고된 예와 다를 수 있습니다. 이러한 이유로 시험할 모든 미정제 추출물은 특정 샘플을 사용할 때 분석 검출 한계 및 감도 범위를 식별하기 위한 적정이 필요합니다. 이 프로토콜은 인간 TOP1의 검출을 위해 최적화되었습니다. 다른 진핵생물 TOP1의 활성을 측정할 수 있지만 NaCl 농도와 배양 시간은 효소 정제 방법 및 최적의 효소 활성에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 더 많은 순환화된 기질은 장기간의 배양으로 인해 발생하는 반면, 더 적은 순환화된 기질은 짧은 배양으로 인해 발생합니다.
제시된 응용 프로그램 외에도 REEAD는 암 환자18의 소규모 생검으로부터의 조 추출물에서 TOP1 활성의 측정, 암 세포주 20,21,22에서 CPT의 세포 독성 항암 효과의 예측, 심지어 단일 세포에서의 효소 활성의 검출을 허용합니다(20,21) . 또한, 웰메이커를 사용하여 제시된 REEAD 설정은 합성 또는 천연 화합물 라이브러리의 멀티웰 기반 약물 스크리닝을 가능하게 합니다. 이 외에도 REEAD C/L이라고 하는 REEAD 분석의 수정된 버전이 개발되었습니다. 이러한 설정은 TOP1 반응(27)의 절단 및 결찰 단계의 개별 조사를 가능하게 한다. REEAD C/L을 사용하면 소분자 억제제의 작용 메커니즘을 결정하고 잠재적인 구충 효과28가 있는 TOP1 촉매 억제제 또는 항암 치료24,25에 사용되는 TOP1 독극물로 특성화할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 TOP1 효소의 다양한 요구 사항(DNA 결합 또는 절단 결찰)과 일치하도록 DNA 기질을 특이적으로 재설계함으로써 REEAD는 감염성 질병(예: 말라리아29를 유발하는 플라스모듐 팔시파룸의 경우) 또는 리슈만편모충 도노바니 및 원숭이두 바이러스(데이터는 표시되지 않음)의 검출에도 사용되었습니다. 또는 항병원성 효과가 있는 소분자 화합물을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 TOP1 분야의 과학자들에게 최적화가 거의 또는 전혀 없이 효소 활성을 검출할 수 있는 쉬운 방법을 제공하며 향후 더 광범위한 응용 분야에 적용할 수 있는 가능성을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Phi29 및 TOP1 효소 정제와 관련된 기술 지원에 대해 오르후스 대학교 분자 생물학 및 유전학과의 실험실 기술자 Noriko Y. Hansen에게 감사드립니다.
Equipment | |||
Camera for fluorescence image analysis | |||
CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
Humidity chamber with dH2O | |||
Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Materials | |||
Cell culture | |||
Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
Trypsin | Sigma | #T4174 | |
Pen strep | Sigma | #P4300 | |
Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
FBS | Gibco | #10270106 | |
NEEA | Sigma | #M7145 | |
PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
Functionalized slides | |||
5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
DNA circles and rolling circle amplification | |||
TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
Detection of rolling circle products | |||
BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
Cover glass | |||
ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
Buffer list | |||
1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Chemicals for buffers | |||
Tris | Sigma | #T1506 | |
HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
PMSF | Sigma | #05056489001 | |
SDS | Applichem | #436143 | |
Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
DTT | Sigma | #D0632 | |
CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
BSA | Sigma | #A4503 |