描述了使用滚动圆增强酶活性检测测定法灵敏和定量检测拓扑异构酶1活性的方案。该方法允许从纯化的组分或细胞/组织提取物中检测拓扑异构酶1活性。该协议在涉及酶活性检测的任何领域具有广泛的应用。
基于等温扩增的技术(如滚环扩增)已成功用于检测核酸、蛋白质量或其他相关分子。这些方法已被证明是临床和研究应用中PCR或ELISA的重要替代品。此外,蛋白质量的检测(通过蛋白质印迹或免疫组织化学)通常不足以为癌症诊断提供信息,而酶活性的测量是一种有价值的生物标志物。酶活性的测量还可以诊断和潜在治疗病原体传播的疾病。在所有真核生物中,拓扑异构酶是参与重要细胞过程中DNA拓扑状态控制的关键DNA结合酶,并且是癌症预后和治疗的重要生物标志物之一。
多年来,拓扑异构酶作为抗寄生虫和抗癌药物的潜在靶标已被大量研究,每年都会研究天然和合成小分子化合物库。这里介绍了滚动环扩增方法,称为滚动圆增强酶活性检测(REEAD)测定,该方法允许以简单,快速和无凝胶的方式定量测量拓扑异构酶1(TOP1)活性。通过切割和连接特殊设计的DNA底物,TOP1将DNA寡核苷酸转化为闭合环,成为滚动环扩增的模板,产生~103 串联重复滚动循环产物。根据扩增过程中的核苷酸掺入情况,有可能有不同的读出方法,从荧光到化学发光再到比色。由于每个 TOP1 介导的切割连接都会产生一个闭合的 DNA 环,因此该测定具有高度灵敏度且直接定量。
拓扑异构酶属于DNA修饰酶类,其中许多已被证明可作为人类疾病的生物标志物1,2,3,4,5,6。TOP1 参与解决与细胞过程相关的拓扑应力,例如 DNA 复制、基因转录、重组和染色体分离7。TOP1 可以通过涉及在 DNA8,9 中形成瞬时单链断裂的机制来解析负极和正极超线圈。与DNA结合后,TOP1定位活性位点酪氨酸(Tyr723)以对磷酸二酯骨架进行亲核攻击。然后生成TOP1-DNA切割复合物,将酶共价连接到断裂DNA链的3’末端。这通过允许裂解的链的 5′ 端围绕完整链旋转来释放扭转应力。最后,5′-末端的羟基对3′-磷酸酪基键进行亲核攻击。结果,TOP1被释放,DNA骨架恢复8。
已经开发了几种测定方法来研究TOP1催化循环的步骤,包括弛豫测定10,电泳迁移率转移测定(EMSA)11,12,DNA自杀切割连接测定13,14和体内酶复合物(ICE)测定15.然而,这些测定有几个局限性,因为它们依赖于凝胶电泳,这需要DNA插层剂,或者它们需要高度专业化的培训和设备。此外,测定需要大量纯化的TOP1酶(松弛测定范围为1至5ng,EMSA和切割连接测定范围为50至200ng)或至少106细胞的提取物才能发挥最佳性能。因此,已经开发了一种高灵敏度的方法,该方法能够在粗生物样品和单一催化事件水平上特异性检测TOP1活性,称为REEAD测定16。
这里介绍了使用REEAD测定16 检测TOP1活性的方案。该测定的示意图如图 1所示。将定制设计的硅胶网格连接到功能化载玻片上,以创建玻璃载玻片多孔设置,在下文中称为造井器(图1A)。随后将5′-氨基修饰引物偶联到载玻片孔中的功能性NHS基团(图1B)。TOP1介导的切割和连接反应将特定的DNA底物转化为闭合的环。TOP1 特异性基板(图 1C)自发折叠成哑铃形,其中包含一个双链茎和两个单链环。其中一个环与表面锚定底漆互补。茎区域包含有利的TOP1裂解位点,位于3’端上游的三个碱基和一个5′-羟基突出。底物的循环化可以使用细胞/组织提取物(图1C)或重组纯化的TOP1(图1D)来实现。
当底物被TOP1裂解时,酶瞬时结合到3’末端,三碱基片段扩散,允许5′-突出部退火到底物上并促进TOP1介导的连接。连接导致底物的环状化,随后导致TOP1的解离。闭合环与表面锚定引物杂交(图1E),并用作由phi29聚合酶介导的等温滚动环扩增(RCA)的模板,该酶可以进行链置换的RCA,产生103 串联重复产物。在RCA步骤中,可以掺入荧光标记的(图1F)或生物素偶联的(图1G)核苷酸17。掺入荧光标记的核苷酸允许使用荧光显微镜或荧光扫描仪检测RCP。或者,辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗生物素抗体(图1H)可以结合生物素化的核苷酸,从而允许使用增强化学发光(ECL)或通过将3,3’,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)转化为可检测的颜色来检测轧圆产物(RCP)。RCA 遵循线性反应动力学,使 REEAD 测定直接定量,因为一个 RCP 代表单个 TOP1 介导的切割连接反应。这里表明,该测定可用于检测TOP1活性作为纯化的重组酶或从粗样品中提取的以及作为抗TOP1药物筛选工具。
拓扑异构酶代表一类DNA修饰酶,吸引了高度研究和临床兴趣,是小分子化合物的靶标,在抗癌治疗或对抗传染病方面具有潜在效果。此外,人类TOP1的活性已被证明是癌症预后和治疗的有效生物标志物18,19,23。虽然影响化疗抑制剂26疗效的是TOP1活性,但在临床环境中评估的通常是DNA-RNA的数量或TOP1的量。这是由于缺乏快速、简单和基于凝胶的免费工具,这些工具可以在每个实验室环境中提供拓扑异构酶活性的准确和精确定量。
这里描述了一种REEAD测定方案,允许以无凝胶的方式测量TOP1活性。在该协议中,从细胞中纯化的TOP1或粗提取物与专门设计的DNA哑铃形底物一起孵育,在TOP1介导的切割/连接时将其转化为封闭的环状分子。然后将圆圈杂交到玻璃表面上并通过RCA放大。为了便于在载玻片上进行反应,在玻璃上安装了一个有机硅网格,在发生反应的地方形成单独的孔。通过这种方式,该协议利用了一个多孔系统 – 一种称为制井机的有机硅网格。
该方案用于检测从结直肠腺癌细胞Caco2中提取的重组TOP1和TOP1的活性,以为例。此外,作为用作药物筛选工具的REEAD的一个例子,该协议用于检测众所周知的TOP1抑制剂CPT24,25的TOP1活性抑制。该测定与不同的读出方法相结合 – 荧光显微镜,其灵敏度高,荧光扫描仪,化学发光或比色法,需要较少的专业设备和培训。高灵敏度荧光显微镜读数的局限性在于需要高质量的荧光显微镜设置、熟练的人员以及耗时的图像采集和分析。
由于这些原因,即使以牺牲灵敏度为代价,也可以更快地采集和分析荧光扫描仪读数。在缺少荧光扫描仪的情况下,可以考虑两种出色的选择,即化学发光和比色读数方法。这两种方法都快速简单,不需要昂贵的设备或专业培训。在所有读数形式中,与最先进的检测方法相比,REEAD具有许多优点,这些检测方法更耗时,基于凝胶(需要插层剂),并且更不直接定量。但是,所提出的协议中有几个关键步骤。在进行药物筛选时,与针对CPT优化的所述设置相比,应优化时间点、药物浓度和TOP1量/DNA底物的比例。 可以研究该药物与DNA底物进行预孵育或与TOP1酶进行预孵育。这可以提供有关分子抑制TOP1的能力的宝贵信息,并提供药物作用机制的见解。
此外,如果信号低或缺失,这很可能是由于粗样品裂解效率低下或由于蛋白酶抑制剂使用不当导致提取物中的TOP1降解。此外,这也可能是由于重要检测组分(如重组TOP1、phi29聚合酶、核苷酸、底物和引物)储存不足。最后,应避免寡核苷酸的重复冻融循环,因为这会极大地影响测定性能。当使用粗提物时,需要优化特定生物样品的提取效率,TOP1的量和活性可能与此处报告的示例不同。因此,使用特定样品时,每种待测试的粗提取物都需要滴定,以确定测定检测限和灵敏度范围。该协议已针对检测人类 TOP1 进行了优化。可以测量其他真核TOP1的活性,但可能需要根据酶纯化方法和最佳酶活性优化NaCl浓度和孵育时间。长时间孵育将产生更多的圆形底物,而缩短孵育时间将导致更少的圆形底物。
除了所介绍的应用外,REEAD还允许测量癌症患者小活检粗提取物中的TOP1活性18,预测CPT在癌细胞系中的细胞毒性抗癌作用20,21,22,甚至检测单细胞中的酶活性20,21.此外,所呈现的使用制井机的REEAD设置能够对合成或天然化合物的文库进行基于多孔的药物筛选。除此之外,还开发了REEAD测定的修改版本,称为REEAD C / L。该设置可以单独研究TOP1反应27的裂解和连接步骤。使用REEAD C / L,可以确定小分子抑制剂的作用机制,并将其表征为具有潜在抗寄生虫作用的TOP1催化抑制剂28或用于抗癌治疗的TOP1毒物24,25。最后,通过对DNA底物进行特定的重新设计,以满足其他TOP1酶的不同要求(用于DNA结合或切割连接),REEAD也被用于检测传染病(例如恶性疟原虫,导致疟疾29),或利什曼原虫和猴痘病毒(数据未显示)。或者,它可用于鉴定具有抗致病作用的小分子化合物。所提出的协议为TOP1领域的科学家提供了一种简单的方法来检测酶活性,几乎没有优化,并且有可能在未来适应更广泛的应用。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢奥胡斯大学分子生物学和遗传学系的实验室技术人员Noriko Y. Hansen在Phi29和TOP1酶纯化方面的技术援助。
Equipment | |||
Camera for fluorescence image analysis | |||
CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
Humidity chamber with dH2O | |||
Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Materials | |||
Cell culture | |||
Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
Trypsin | Sigma | #T4174 | |
Pen strep | Sigma | #P4300 | |
Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
FBS | Gibco | #10270106 | |
NEEA | Sigma | #M7145 | |
PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
Functionalized slides | |||
5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
DNA circles and rolling circle amplification | |||
TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
Detection of rolling circle products | |||
BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
Cover glass | |||
ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
Buffer list | |||
1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Chemicals for buffers | |||
Tris | Sigma | #T1506 | |
HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
PMSF | Sigma | #05056489001 | |
SDS | Applichem | #436143 | |
Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
DTT | Sigma | #D0632 | |
CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
BSA | Sigma | #A4503 |