Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster
Summary
O presente protocolo descreve a indução de autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de nutrientes e analisa as alterações na autofagia utilizando linhagens de moscas transgênicas.
Abstract
A autofagia é um processo de autodigestão celular. Ele entrega carga aos lisossomos para degradação em resposta a vários estresses, incluindo fome. O mau funcionamento da autofagia está associado ao envelhecimento e a múltiplas doenças humanas. A maquinaria de autofagia é altamente conservada – desde leveduras até humanos. O corpo adiposo larval de Drosophila melanogaster, um análogo para fígado e tecido adiposo de vertebrados, fornece um modelo único para o monitoramento da autofagia in vivo. A autofagia pode ser facilmente induzida pela falta de nutrientes no corpo adiposo das larvas. A maioria dos genes relacionados à autofagia é conservada em Drosophila. Muitas linhagens de moscas transgênicas expressando marcadores de autofagia marcados foram desenvolvidas, o que facilita o monitoramento de diferentes etapas do processo de autofagia. A análise clonal permite uma comparação próxima de marcadores de autofagia em células com genótipos diferentes no mesmo pedaço de tecido. O protocolo atual detalha procedimentos para (1) gerar clones somáticos no corpo adiposo larval, (2) induzir autofagia via inanição de aminoácidos e (3) dissecar o corpo adiposo larval, com o objetivo de criar um modelo para análise de diferenças na autofagia utilizando um marcador autofagossomal (GFP-Atg8a) e análise clonal.
Introduction
A autofagia é um processo de “autoalimentação” induzido por vários estresses, incluindo a inanição de aminoácidos1. A macroautofagia (doravante denominada autofagia) é o tipo de autofagia mais bem estudado e desempenha um papel insubstituível na manutenção da homeostase celular2. O mau funcionamento da autofagia está associado a diversas doençashumanas3. Além disso, alguns genes relacionados à autofagia são alvos potenciais para o tratamento de váriasdoenças4.
A autofagia é regulada de forma altamente sofisticada5. Após a inanição, as membranas de isolamento sequestram materiais citoplasmáticos para formar autofagossomos de membrana dupla6. Os autofagossomos então se fundem com endossomos e lisossomos para formar anfissomos e autolisossomos. Com a ajuda de enzimas hidrolíticas lisossômicas, o conteúdo citoplasmático engolido é degradado e os nutrientes são reciclados7.
A autofagia é um processo conservado evolutivamente8. Drosophila melanogaster é um ótimo modelo para o estudo do processo de autofagia in vivo. A inanição de aminoácidos induz facilmente autofagia no tecido adiposo das moscas, um análogo do fígado e do tecido adiposo humanos9. Defeitos na autofagia interrompem os distintos padrões puncta de várias proteínas relacionadas à autofagia, como Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1, p62, entre outras10. Portanto, a análise dos padrões desses marcadores de autofagia ajudará a discernir a ocorrência de defeitos de autofagia e a etapa de autofagia defeituosa. Por exemplo, a proteína semelhante à ubiquitina Atg8 é o marcador de autofagia mais comumente usado11. Em Drosophila melanogaster, cepas transgênicas com uma proteína fluorescente verde (GFP) marcada com Atg8a foram desenvolvidas com sucesso12. GFP-Atg8a é difundida no citosol e núcleos nas células alimentadas. Após a inanição, a GFP-Atg8a é processada e modificada pela fosfatidiletanolamina (PE) e forma puncta, que marcam as membranas de isolamento e os autofagossomos totalmente desenvolvidos13,14. Através da microscopia direta de fluorescência, a indução da autofagia pode ser facilmente observada como um aumento na formação de puncta GFP-Atg815. Atg8a puncta não se formaria em resposta à inanição na presença de um defeito de iniciação da autofagia. Como GFP-Atg8a pode ser extinta e digerida pelo pH baixo em autolisossomos, GFP-Atg8a puncta pode aumentar em número se a autofagia for bloqueada em estágios tardios16.
Como a autofagia é altamente sensível à disponibilidade nutricional17, pequenas diferenças nas condições de cultura frequentemente levam a variações nos fenótipos. Portanto, a análise clonal, método que analisa células mutantes versus células controle selvagens de um mesmo tecido, tem grande vantagem na dissecção de defeitos autofágicos18. Aproveitando a recombinação sítio-específica mediada por flippase/flippase (FLP/FRT) entre cromossomos homólogos, moscas portadoras de tecidos em mosaico são prontamente confeccionadas19,20. As células selvagens que circundam as células mutantes formam um controle interno perfeito para evitar diferenças individuais21.
O presente estudo descreve como induzir autofagia por inanição de aminoácidos e gerar tecidos corporais de gordura em mosaico que expressam GFP-Atg8a. Esses protocolos podem ser utilizados para analisar diferenças na autofagia entre clones mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo descreve os métodos para (1) gerar moscas portadoras de clones mutantes nos corpos gordurosos das larvas, (2) induzir autofagia através da inanição de aminoácidos e (3) dissecar os corpos gordurosos das larvas. A fim de gerar clones com sucesso nos corpos gordurosos das larvas, as seguintes etapas críticas precisam ser realizadas diligentemente. (1) Cronometrar o choque térmico com precisão é crucial, pois a recombinação mitótica só ocorre quando o tecido está sofrendo mitose, e (2) tan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos à THFC e à BDSC por fornecerem as cepas de mosca. O Dr. Tong Chao é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32030027, 91754103, 92157201) e fundos de pesquisa fundamental para as universidades centrais. Agradecemos à instalação central do Instituto de Ciências da Vida (LSI) pela prestação de serviços.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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