تحليل الالتهام الذاتي الناجم عن الجوع في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة
Summary
يصف هذا البروتوكول تحريض الالتهام الذاتي في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة عن طريق استنفاد المغذيات ويحلل التغيرات في الالتهام الذاتي باستخدام سلالات الذباب المعدلة وراثيا.
Abstract
الالتهام الذاتي هو عملية الهضم الذاتي الخلوية. يسلم البضائع إلى الجسيمات الحالة للتحلل استجابة للضغوط المختلفة ، بما في ذلك الجوع. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالشيخوخة والأمراض البشرية المتعددة. يتم الحفاظ على آلية الالتهام الذاتي بشكل كبير – من الخميرة إلى البشر. يوفر الجسم الدهني اليرقي لذبابة الفاكهة ، وهو نظير للكبد الفقاري والأنسجة الدهنية ، نموذجا فريدا لمراقبة الالتهام الذاتي في الجسم الحي. يمكن أن يحدث الالتهام الذاتي بسهولة عن طريق تجويع المغذيات في جسم الدهون اليرقية. يتم حفظ معظم الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي في ذبابة الفاكهة. تم تطوير العديد من سلالات الذباب المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامات الالتهام الذاتي الموسومة ، مما يسهل مراقبة الخطوات المختلفة في عملية الالتهام الذاتي. يتيح التحليل النسيلي مقارنة وثيقة لعلامات الالتهام الذاتي في الخلايا ذات الأنماط الجينية المختلفة في نفس قطعة الأنسجة. يفصل البروتوكول الحالي إجراءات (1) توليد استنساخ جسدي في جسم الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح جسم الدهون اليرقية ، بهدف إنشاء نموذج لتحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي باستخدام علامة البلعمة الذاتية (GFP-Atg8a) والتحليل النسيلي.
Introduction
الالتهام الذاتي هو عملية “الأكل الذاتي” التي تسببها ضغوط مختلفة ، بما في ذلك تجويع الأحماض الأمينية1. الالتهام الذاتي الكبير (المشار إليه فيما يلي باسم الالتهام الذاتي) هو أكثر أنواع الالتهام الذاتي المدروسة جيدا ويلعب دورا لا غنى عنه في الحفاظ على التوازن الخلوي2. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالعديد من الأمراض البشرية3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي هي أهداف محتملة لعلاج الأمراض المختلفة4.
يتم تنظيم الالتهام الذاتي بطريقة متطورة للغاية5. عند الجوع ، تقوم أغشية العزل بعزل المواد السيتوبلازمية لتشكيل البلعمة الذاتية مزدوجة الغشاء6. ثم تندمج البلعمة الذاتية مع الإندوسومات والليزوزومات لتكوين البرمائيات والليزوزومات. بمساعدة الإنزيمات المائية الليزوزومية ، تتحلل محتويات السيتوبلازم المبتلع ، ويتم إعادة تدوير العناصر الغذائية7.
الالتهام الذاتي هو عملية محفوظة تطوريا8. ذبابة الفاكهة الميلانية هي نموذج رائع لدراسة عملية الالتهام الذاتي في الجسم الحي. يؤدي تجويع الأحماض الأمينية بسهولة إلى الالتهام الذاتي في أنسجة الجسم الدهنية الذبابة ، وهو نظير للكبد البشري والأنسجة الدهنية9. تؤدي العيوب في الالتهام الذاتي إلى تعطيل أنماط النقاط المميزة للعديد من البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي ، مثل Atg8 و Atg9 و Atg18 و Syx17 و Rab7 و LAMP1 و p62 ، من بين أمور أخرى10. لذلك ، فإن تحليل أنماط علامات الالتهام الذاتي هذه سيساعد في تمييز حدوث عيوب الالتهام الذاتي وخطوة الالتهام الذاتي المعيبة. على سبيل المثال ، البروتين الشبيه باليوبيكويتين Atg8 هو علامة الالتهام الذاتي الأكثر استخداما11. في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، تم تطوير سلالات معدلة وراثيا مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم Atg8a بنجاح12. ينتشر GFP-Atg8a في السيتوسول والنوى في الخلايا المغذية. عند الجوع ، تتم معالجة GFP-Atg8a وتعديلها بواسطة فوسفاتيديل إيثانولامين (PE) وتشكل نقطة ، والتي تسمي أغشية العزل والبلعمة الذاتية المطورةبالكامل 13,14. من خلال الفحص المجهري الفلوري المباشر ، يمكن ملاحظة تحريض الالتهام الذاتي بسهولة كزيادة في تكوين النقاط GFP-Atg815. لن تتشكل Atg8a puncta استجابة للمجاعة في وجود عيب في بدء الالتهام الذاتي. نظرا لأنه يمكن إخماد GFP-Atg8a وهضمه بواسطة انخفاض درجة الحموضة في الجسيمات الذاتية ، فقد تزداد أرقام GFP-Atg8a puncta إذا تم حظر الالتهام الذاتي في المراحلالمتأخرة 16.
نظرا لأن الالتهام الذاتي حساس للغاية لتوافر التغذية17 ، فإن الاختلافات الطفيفة في ظروف الثقافة غالبا ما تؤدي إلى اختلافات في الأنماط الظاهرية. لذلك ، فإن التحليل النسيلي ، وهو طريقة تحلل الخلايا الطافرة مقابل خلايا التحكم من النوع البري في نفس النسيج ، له ميزة كبيرة في تشريح عيوب الالتهام الذاتي18. من خلال الاستفادة من هدف التعرف على flippase / flippase (FLP / FRT) بوساطة إعادة التركيب الخاصة بالموقع بين الكروموسومات المتماثلة ، يتم تصنيع الذباب الذي يحمل أنسجة الفسيفساء بسهولة19,20. تشكل الخلايا البرية المحيطة بالخلايا الطافرة تحكما داخليا مثاليا لتجنب الاختلافات الفردية21.
تصف الدراسة الحالية كيفية تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق تجويع الأحماض الأمينية وتوليد أنسجة الجسم الدهنية الفسيفسائية التي تعبر عن GFP-Atg8a. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي بين الحيوانات المستنسخة الطافرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طرق (1) توليد الذباب الذي يحمل مستنسخات متحولة في أجسام الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي من خلال تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح أجسام الدهون اليرقية. من أجل توليد الحيوانات المستنسخة بنجاح في أجسام الدهون اليرقات ، يجب تنفيذ الخطوات الحاسمة التالية بجد. (1) يع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون ل THFC و BDSC لتوفير سلالات الذباب. يتم دعم الدكتور تونغ تشاو من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32030027 ، 91754103 ، 92157201) وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية. نشكر المرفق الأساسي في معهد علوم الحياة (LSI) على تقديم الخدمات.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
