Raccolta e mantenimento a lungo termine delle formiche tagliafoglie (Atta) in condizioni di laboratorio

Summary

Qui, viene descritto un protocollo per raccogliere e mantenere con successo colonie di formiche Atta (Hymenoptera: Formicidae) sane in condizioni di laboratorio. Inoltre, diversi tipi e configurazioni di nidificazione sono dettagliati insieme a possibili procedure sperimentali.

Abstract

Le formiche sono uno dei gruppi di animali più ricchi di biodiversità del pianeta e abitano ambienti diversi. Il mantenimento delle colonie di formiche in ambienti controllati consente una comprensione arricchita della loro biologia che può contribuire alla ricerca applicata. Questa pratica è solitamente impiegata negli studi di controllo della popolazione di specie che causano perdite economiche, come le formiche Atta . Per coltivare il loro fungo mutualistico, queste formiche tagliafoglie raccolgono foglie e per questo sono considerate parassiti agricoli ampiamente distribuiti in tutto il continente americano. Sono altamente organizzati socialmente e abitano nidi sotterranei elaborati composti da una varietà di camere. Il loro mantenimento in un ambiente controllato dipende da una routine quotidiana di diverse procedure e cure frequenti che sono descritte qui. Inizia con la raccolta delle regine durante la stagione riproduttiva (cioè il volo nuziale), che vengono poi trasferite individualmente in contenitori di plastica. A causa dell’alto tasso di mortalità delle regine, una seconda raccolta può essere effettuata circa 6 mesi dopo il volo nuziale, quando i nidi incipienti con batuffolo fungino sviluppato vengono scavati, raccolti a mano e collocati in contenitori di plastica. Nel laboratorio, le foglie vengono fornite quotidianamente alle colonie stabilite e i rifiuti prodotti dalle formiche vengono rimossi settimanalmente insieme al materiale vegetale secco rimanente. Mentre il giardino dei funghi continua a crescere, le colonie vengono trasferite in diversi tipi di contenitori in base allo scopo sperimentale. Le colonie di formiche tagliafoglie sono collocate in contenitori interconnessi, che rappresentano il sistema organizzativo con camere funzionali costruite da quegli insetti in natura. Questa configurazione è ideale per monitorare fattori quali la quantità di rifiuti, la salute del giardino dei funghi e il comportamento dei lavoratori e della regina. La raccolta facilitata dei dati e le osservazioni più dettagliate sono considerate il più grande vantaggio di mantenere le colonie di formiche in condizioni controllate.

Introduction

Le formiche compongono un gruppo eterogeneo di individui che esercitano un’influenza sulla maggior parte degli ambienti terrestri¹. Agiscono come efficienti dispersori ^2,3,4, predatori⁵ e ingegneri ecosistemici 6,7,8,9,10^, evidenziando la loro importanza e successo ecologico sugli ecosistemi naturali. Tutte le specie di formiche sono classificate come insetti eusociali; Tuttavia, la loro organizzazione sociale varia notevolmente tra i diversi gruppi di specie, cioè i sistemi di divisione del lavoro, i gruppi funzionali, la comunicazione tra gli individui, l’organizzazione del foraggio, la fondazione della colonia e il processo di riproduzione¹¹. Come gruppo altamente diversificato, ricorrono a diverse risorse alimentari e comportamenti alimentari specializzati. È un dato di fatto, l’agricoltura non è stata solo un enorme passo per la civiltà umana, ma anche per le specie di formiche. Circa 55-65 Ma^{fa 12}, le formiche attine hanno iniziato a coltivare funghi e incorporarli in una dieta quasi esclusiva. Sono diventati così specializzati che hanno sviluppato interazioni rigorose, dipendenti e obbligatorie classificate come simbiosi, in cui un individuo non sopravvive senza l’altro.

Le formiche che crescono funghi inferiori raccolgono e trattano la materia organica morta, come frammenti di foglie in decomposizione, per far crescere il loro fungo mutualistico; mentre le formiche più alte che crescono funghi raccolgono materiale vegetale fresco, componendo uno dei sistemi naturali simbiotici di maggior successo¹³. Questa tecnica agricola altamente specializzata ha permesso loro di cogliere una nuova nicchia. Le formiche attine superiori comprendono le formiche tagliafoglie, un gruppo monofiletico che suscita tra 19 Ma (15-24 Ma) e 18 Ma (14-22 Ma)^14,15,16 composto da quattro generi validi: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr^, Amoimyrmex Cristiano e Pseudoatta Gallardo. Il sistema di agricoltura tagliafoglie eseguito dalle formiche tagliafoglie, si è evoluto dai sistemi agricoli derivati¹⁷. La maggior parte di queste specie sfrutta esclusivamente la specie fungina mutualistica Leucoagaricus gongylophorus Singer¹⁸ (chiamata anche Leucocoprinus gongylophorus Heim 19), segnando una significativa transizione evolutiva¹¹. Le cultivar fungine sono trasmesse verticalmente, dai nidi originali alla prole, suggerendo che siano clonalmente propagate²⁰.

Sorprendentemente, le società Atta svilupparono una complessa struttura organizzativa di enorme importanza nel loro ambiente e di grande interesse per i mirmecologi. La loro popolazione può essere composta da milioni di individui, la maggior parte dei quali operaie sterili che mostrano un accentuato polimorfismo, cioè dimensioni e morfologia anatomica distinte. La popolazione si distingue per caste in base all’età, allo stato fisiologico, al tipo morfologico, ai comportamenti e alle attività specializzate nella colonia²¹. I lavoratori possono essere discriminati in giardinieri e infermieri, generalisti all’interno del nido, raccoglitori ed escavatori, difensori o soldati²¹. Questa organizzazione consente l’esecuzione di compiti in cooperazione e un sistema auto-organizzante in grado di produrre comportamenti collettivi altamente strutturati, consentendo loro di rispondere in modo efficiente ai disturbi ambientali²².

Il ruolo di rinnovamento della popolazione è svolto da una singola regina (cioè monogina), per tutto il tempo in cui vive, costituendo la casta riproduttiva permanente²². Le regine Atta sono note per vivere per più di 20 anni, deponendo le uova per tutta la loro durata di vita²³. Poiché la regina è insostituibile, la sua resistenza è cruciale per la sopravvivenza della colonia ^13,20,23,24. Tuttavia, migliaia di femmine e maschi riproduttivi alati possono essere trovati nel nido durante le stagioni riproduttive, ma nessuno rimane nel nido originale, formando una casta temporanea²². Nelle colonie di Atta sexdens, quasi 3.000 femmine riproduttive e 14.000 maschi riproduttivi ne producono²⁵. Si verifica quando una colonia raggiunge la maturità sessuale, circa 38 mesi dalla sua realizzazione, e si ripete annualmente da allora fino a quando non si estingue^23,25. Le nuove colonie di Atta si stabiliscono attraverso l’aplometrosi, dove una regina inizia un nuovo nido.

Quando le condizioni ambientali sono favorevoli, i riproduttori lasciano il nido sotterraneo per iniziare il volo nuziale. Il periodo della sua presenza differisce da regione a regione, variando lungo l’anno in tutto il territorio brasiliano a seconda della specie. Tuttavia, l’evento sembra essere preceduto da precipitazioni e umidità²⁶, che possono essere correlate alla facilitazione dello scavo dovuta all’umidità del suolo²². Frequentemente, 1-5 settimane prima del volo nuziale, gli ingressi e i canali del nido vengono allargati per facilitare la partenza degli individui riproduttivi. Prima di lasciare le loro colonie madri, le femmine alate raccolgono e immagazzinano, in una cavità infrabuccale, una porzione del fungo mutualistico^20,27. Copulazioni multiple vengono eseguite a metà volo, e si calcola che una regina possa essere inseminata da tre a otto maschi (cioè poliandria) in alcune specie²⁸, garantendo la variabilità genetica²⁹. In seguito, le regine procedono verso il suolo, dando la preferenza a luoghi con poca o nessuna vegetazione²⁵, dove rimuovono le ali e scavano la loro prima camera di nido. Questo è l’unico periodo in cui le regine possono essere viste al di fuori del nido. Sebbene gli individui della casta temporanea siano stati visti in nidi artificiali, non è noto se una copulazione riuscita (cioè il volo nuziale) sia stata eseguita in condizioni^{di laboratorio 24}.

La costruzione iniziale del nido corrisponde al periodo più cruciale della colonia, che può durare da 6 h a 8 h^23,25. In questo momento, la regina si chiude nella camera iniziale e, nel giro di pochi giorni, inizia l’ovideposizione. Le prime uova vengono somministrate al miceliale che la regina rigurgita, segnando l’inizio del giardino dei funghi della colonia. Le prime larve compaiono in circa 25 giorni²², e quasi alla fine del primo mese, la colonia consiste in un tappeto di funghi proliferanti, dove sono annidati gli immaturi (uova, larve e pupe) e la regina, che alleva la sua prole iniziale in isolamento²³. Le uova sono anche la risorsa alimentare delle prime larve e molto consumate dalla regina¹³. Inoltre, la regina si sostiene con riserve di corpo grasso e catabolizzando i muscoli delle ali che non sono più utili¹³. La coltura fungina iniziale non viene consumata poiché la sopravvivenza della colonia dipende dal suo sviluppo e, durante questo periodo, la regina la fertilizza con liquido fecale¹³. Giorni dopo essere emerse, le prime operaie aprono l’ingresso del nido e iniziano un’attività di foraggiamento nelle immediate vicinanze del nido¹³. Incorporano il materiale raccolto come substrato del giardino dei funghi, che ora serve come cibo per i lavoratori^13,22. Prima di essere aggiunto alla coltura fungina, il materiale vegetale trasportato dai lavoratori viene tagliato in piccoli pezzi e inumidito con liquido fecale¹³. Le formiche manipolano l’inoculo fungino per aumentarne e controllarne la crescita, che servirà per la suddivisione delle grandi camere scavate del terreno, specializzate nel condizionamento del giardino 13,22,25.

Circa 6 mesi dopo il volo nuziale, i nidi di A. sexdens contengono una camera fungina e alcuni canali. La grande specializzazione nella costruzione di nidi di formiche tagliafoglie funziona come meccanismo di difesa contro i nemici naturali e fattori ambientali sfavorevoli²². Le formiche tagliafoglie sono note per frammentare il giardino dei funghi e trasporlo in camere con elevata umidità quando le camere iniziano ad asciugarsi¹³. Così, nonostante lo scavo del nido abbia un costo energetico considerevole, l’energia investita viene invertita in benefici per la colonia stessa²². Con poche eccezioni, le specie Atta creano anche camere specializzate per i rifiuti della colonia, fatte principalmente di substrato fungino impoverito e corpi di formiche morte, isolandolo dal resto del nido e stabilendo un’importante strategia di immunità sociale³⁰. Inoltre, un gruppo distinto di lavoratori manipola direttamente i rifiuti, per evitare la contaminazione di altri individui. I lavoratori si nutrono costantemente del fungo, che è la principale risorsa nutrizionale della colonia. Tuttavia, possono nutrirsi anche di linfa delle piante mentre tagliano frammenti. Il materiale vegetale è accuratamente selezionato per la manutenzione del giardino dei funghi e influenzato da molti fattori come i tratti fogliari e le proprietà dell’ecosistema¹³.

La strategia di foraggiamento delle formiche tagliafoglie per ottenere materiale fresco è molto complessa e, combinata con l’elevata domanda di raccolto delle colonie stabilite, comporta notevoli perdite economiche per i produttori agricoli e mette a repentaglio le aree di ripristino forestale^22,31. Pertanto, queste formiche possono essere classificate come parassiti nella maggior parte delle aree in cui possono essere incontrate, che vanno dagli Stati Uniti meridionali all’Argentina nord-orientale 11,13,22,32. L’estinzione delle colonie problematiche è difficile a causa della serie di adattamenti inerenti alla biologia di questi insetti (cioè organizzazione sociale, foraggiamento, coltivazione di funghi, igiene e strutture complesse del nido)³³. Pertanto, le strategie di controllo della popolazione sono distinte da quelle generalmente applicate ad altri insetti nocivi e ricorrono principalmente a interessanti offerte di esche contaminate^33,34. Tuttavia, poiché queste formiche possono respingere le sostanze nocive sia per il fungo che per gli individui della colonia e compromettere i campi coltivati 33, nuovi composti naturali e alternative di controllo vengono costantemente testati^33,35,36. Poiché i risultati degli esperimenti difficilmente possono essere monitorati su colonie testate sul campo, i saggi preliminari sono condotti in un ambiente controllato.

Pertanto, i protocolli sperimentali devono essere adattati ai gruppi di interesse considerando lo stile di vita eterogeneo delle formiche, sostenendo studi a livello di specie e tenendo conto delle colonie come unità operative, dove una formica è un elemento di un superorganismo complesso¹¹. I rapporti raccolti finora riguardanti il genere Atta hanno reso possibile raccogliere e mantenere con successo le colonie in condizioni di laboratorio e riconoscere i loro bisogni di base e il loro funzionamento generale. Sulla base dei loro processi naturali come la riproduzione, la fondazione di colonie e i comportamenti alimentari, è stata sviluppata una routine di pratiche che consente la creazione a lungo termine di colonie in diversi tipi di nidi. Qui, viene descritto un protocollo procedurale per mantenere le formiche tagliafoglie in laboratorio ed evidenzia possibili ricerche generali con scopi di sperimentazione distinti e divulgazione scientifica.

Protocol

1. Collezione di regine Cerca in letteratura il periodo della stagione riproduttiva di Atta nella regione di interesse. La frequenza della stagione riproduttiva, la frequenza e l’ora diurna dei voli nuziali variano a seconda delle condizioni climatiche regionali (Tabella 1). Sebbene si svolga generalmente in primavera, queste informazioni devono essere raccolte per il luogo in cui è prevista la raccolta 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46….

Representative Results

Un diagramma di flusso che illustra il processo di raccolta delle formiche è mostrato nella Figura 6. Qui vengono mostrati alcuni risultati ottenuti utilizzando il protocollo di raccolta, manutenzione e configurazioni del nido sopra descritto. Figura 6: Diagramma di flusso per la raccolta delle colo…

Discussion

Il protocollo qui descritto per mantenere le colonie di formiche tagliafoglie è stato sviluppato e applicato per oltre tre decenni in modo assertivo e replicabile. Ha permesso lo sviluppo di ricerche che sarebbero state limitate dalle condizioni del campo. In tal modo, formiche e colonie sane sono diventate disponibili per la ricerca in diverse aree come morfologia comparativa, tossicologia 51,52, istologia⁵³ e microbiologia^54,55,56<…

Materials

Entomologic forceps	N/A	N/A	N/A
Glass tank	N/A	N/A	Tempered glass, custom made
Hose	N/A	N/A	Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves	Descarpack	550301	N/A
Nitrile gloves	Descarpack	433301	N/A
Open arena	N/A	N/A	Polypropylene crate
Plaster pouder	N/A	N/A	Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection	Prafesta	Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262	Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests	Prafesta	Discontinued	Polystyrene, hermetic
Teflon	Dupont	N/A	Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)