Мы сообщаем о методе, позволяющем в реальном времени визуализировать динамику микротрубочек в клетках глиобластомы (GBM), вторгающихся в ткань мозга позвоночных. Соединение ортотопической инъекции флуоресцентно помеченных клеток GBM в прозрачный мозг рыбок данио с прижизненной визуализацией высокого разрешения позволяет измерять динамику цитоскелета во время инвазии рака in situ .
С мрачным средним временем выживания в реальных популяциях – от 6 до 15 месяцев – глиобластома (GBM) является наиболее разрушительной злокачественной опухолью головного мозга. Неудача лечения в основном обусловлена инвазивностью клеток GBM, что говорит о необходимости лучшего понимания подвижных свойств GBM. Для исследования молекулярного механизма, поддерживающего инвазию GBM, требуются новые физиологические модели, позволяющие углубленно характеризовать динамику белка во время инвазии. Эти наблюдения проложат путь к открытию новых целей для блокирования инфильтрации опухоли и улучшения результатов лечения пациентов. В этой статье сообщается, как ортотопический ксенотрансплантат клеток GBM в мозге рыбок данио позволяет субклеточную прижизненную живую визуализацию. Сосредоточив внимание на микротрубочках (МТ), мы описываем процедуру маркировки МТ в клетках GBM, микроинъекции клеток GBM в прозрачный мозг через 3 дня после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио, прижизненной визуализации МТ в диссеминирующих ксенотрансплантатах, изменения динамики МТ для оценки их роли во время инвазии GBM и анализа полученных данных.
Подвижность клеток является стереотипным процессом, требующим установления оси полярности и силообразующих цитоскелетных перестроек. Полимеризация актина и его связь с миозином признаны основными факторами, способствующими протрузивным и сократительным силам, необходимым для движения клеток1. Микротрубочки считаются основными действующими лицами в поляризации клеток и направленной персистенции во время миграции2. В последние годы было также показано, что МТ создают и стабилизируют протрузии для поддержки механокомпрессивных сил во время инвазии клеток в 3D3. В последнее время МТ принимают непосредственное участие в механотрансдукции при фокальных спайках и механочувствительной миграции4. Динамическая нестабильность, характеризующая конечную динамику МТ-плюс, состоит из повторяющихся фаз полимеризации (роста) и деполимеризации (усадки), которые контролируются множеством микротрубочек-связывающих белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, таких как управляемые RHO-GTPases 5,6,7. Роль сети МТ в миграции и инвазии клеток сделала исследование динамики МТ ключевым элементом для лучшего понимания механизмов самонаведения иммунных клеток, заживления ран и инвазии рака.
Способность раковых клеток покидать первичное ядро опухоли, распространяться в тканях и генерировать вторичные опухоли является критическим шагом в предотвращении глобального успеха в войне против рака, объявленной 50 лет назад 8,9. Одним из самых больших препятствий было понимание того, как раковые клетки активно вторгаются в ткани. Ключевые механизмы инвазии основаны на тех же принципах, что и те, которые управляют миграцией неопухолевых клеток10. Тем не менее, особенности миграции раковых клеток выявили11, что вызвало необходимость лучшей характеристики этого типа миграции. В частности, поскольку микроокружение опухоли выступает в качестве ключевого игрока в прогрессировании рака12, наблюдение и анализ инвазии раковых клеток в соответствующем физиологическом контексте имеет важное значение для разгадки механизмов распространения раковых клеток.
МТ играют центральную роль в прогрессировании рака, чтобы поддерживать как пролиферацию, так и инвазию. Точный анализ динамики МТ in situ может помочь идентифицировать МТ-изменяющие агенты (МТА) в обоих процессах. Динамика MT резко меняется в зависимости от изменения окружающей среды. In vitro лечение МТ-дестабилизирующими агентами, такими как нокодазол, предотвращает образование протрузии клеток, когда клетки встроены в гели в 3D, тогда как оно мало влияет на миграцию 2D клеток13,14. Несмотря на технические сложности, достижения в области прижизненной визуализации позволяют in vivo анализировать динамику МТ во время инвазии раковых клеток. Например, наблюдение МТ в подкожно ксенотрансплантированных клетках фибросаркомы у мышей показало, что опухолеассоциированные макрофаги влияют на динамику МТ в опухолевых клетках15. Тем не менее, эти мышиные модели включают обширные хирургические процедуры и остаются неудовлетворительными для менее доступных видов рака, таких как высокоинвазивная опухоль головного мозга, GBM.
Несмотря на мрачное 15-месячное среднее время выживания16, мало что известно о способе распространения GBM в паренхиме мозга или ключевых молекулярных элементах, поддерживающих инвазию клеток GBM в ткани мозга. Улучшение модели ортотопического ксенотрансплантата мышей (PDX) и создание черепных окон открыли новые перспективы для исследований инвазии клеток GBM17,18. Однако из-за неоптимального качества визуализации эта модель в основном позволяла продольную визуализацию поверхностных ксенотрансплантатов и до сих пор не была успешно использована для изучения субклеточной визуализации белков цитоскелетов. Кроме того, после введения запрета “3R” на сокращение использования грызунов и замену их низшими позвоночными были созданы альтернативные модели.
Используя преимущества примитивного иммунитета, наблюдаемого у личинок рыбок данио (Danio rerio), ортотопическая инъекция клеток GBM в мозг рыбы была разработана 19,20,21. Инъекция в непосредственной близости от желудочков в развивающемся среднем мозге рекапитулирует большую часть патофизиологии GBM человека21, и наблюдается та же предпочтительная картина инвазии GBM, что и у человека – ко-вариант сосудов –22. Благодаря прозрачности личинок рыб эта модель позволяет визуализировать клетки GBM, вторгающиеся в мозг из перижелудочковых областей, где, как полагают, возникает большинство GBM23.
Поскольку МТ необходимы для инвазии клеток GBM in vitro 24,25, необходима лучшая характеристика динамики МТ и идентификация ключевых регуляторов во время клеточной инвазии. Однако на сегодняшний день данные, полученные с помощью ортотопической модели рыбок данио, не включали субклеточный анализ динамики МТ в процессе инвазии. В данной работе представлен протокол для изучения динамики МТ in vivo и определения ее роли при инвазии рака мозга. После стабильной маркировки микротрубочек клетки GBM микроинъецируются с 3 dpf в мозг личинок рыбок данио и визуализируются в режиме реального времени с высоким пространственно-временным разрешением во время их прогрессирования в ткани мозга. Живая визуализация флуоресцентных МТ позволяет проводить качественный и количественный анализ динамики МТ плюс-энд. Кроме того, эта модель позволяет оценить влияние MTA на динамику MT и на инвазивные свойства клеток GBM в режиме реального времени. Этот относительно неинвазивный протокол в сочетании с большим количеством личинок, обрабатываемых одновременно, и простотой применения препарата (в рыбьей воде) делает модель активом для доклинических испытаний.
Визуализация опухолевых ксенотрансплантатов с одноклеточным разрешением, вероятно, станет незаменимым инструментом для улучшения нашего понимания биологии GBM. Живая визуализация в мышиных моделях PDX привела к ценным открытиям о том, как GBM коллективно вторгается в ткань мозга<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Мы чрезвычайно благодарны доктору. Хербомелю (Институт Пастера, Франция) и его лаборатории, особенно Валери Бриола и Эмме Колуччи-Гийон за предоставление нам линий для рыбок данио и пластиковой формы для микроинъекционных пластин, а также за их ценный опыт в экспериментальных процедурах рыбок данио. Мы с благодарностью выражаем признательность UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, при поддержке Французского национального исследовательского агентства France BioImaging, и ANR-10-INBS-04; Инвестиции в будущее). Эта работа была поддержана Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Национальный центр научных исследований и Институт Пастера, а также благодаря щедрым пожертвованиям г-жи Маргариты МИШЕЛЬ и г-на Порке.
Glioblastoma cell culture | |||
Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
Lenitivirus production | |||
BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
Cell passaging and staining | |||
dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
Zebrafish husbandry | |||
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
Xenotransplantation | |||
24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
Intravital Imaging | |||
3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
Drug Treatment | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
Image Analysis | |||
Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |