We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.
Met een sombere mediane overlevingstijd in echte populaties – tussen 6 en 15 maanden – is glioblastoom (GBM) de meest verwoestende kwaadaardige hersentumor. Falen van de behandeling is voornamelijk te wijten aan de invasiviteit van GBM-cellen, wat spreekt voor de behoefte aan een beter begrip van GBM-beweeglijke eigenschappen. Om het moleculaire mechanisme ter ondersteuning van GBM-invasie te onderzoeken, zijn nieuwe fysiologische modellen nodig die een diepgaande karakterisering van eiwitdynamiek tijdens de invasie mogelijk maken. Deze observaties zouden de weg vrijmaken voor de ontdekking van nieuwe doelen om tumorinfiltratie te blokkeren en de resultaten voor patiënten te verbeteren. Dit artikel meldt hoe een orthotopisch xenograft van GBM-cellen in de hersenen van zebravissen subcellulaire intravitale live beeldvorming mogelijk maakt. Gericht op microtubuli (MT’s), beschrijven we een procedure voor MT-etikettering in GBM-cellen, micro-injectie van GBM-cellen in de transparante hersenen van 3 dagen na bevruchting (dpf) zebravislarven, intravitale beeldvorming van MT’s in de verspreidende xenografts, het veranderen van MT-dynamiek om hun rol tijdens GBM-invasie te beoordelen en het analyseren van de verkregen gegevens.
Celmotiliteit is een stereotiep proces dat polariteitsasvorming en krachtgenererende cytoskeletale herschikkingen vereist. Actinepolymerisatie en de associatie met myosine worden erkend als de belangrijkste bijdragen aan uitsteek- en contractiele krachten die nodig zijn voor celbeweging1. Microtubuli worden beschouwd als de belangrijkste actoren in celpolarisatie en directionele persistentie tijdens migratie2. In de afgelopen jaren is ook aangetoond dat MT’s uitsteeksels creëren en stabiliseren om mechanocompressieve krachten te ondersteunen tijdens celinvasie in 3D3. Meer recent zijn MT’s direct betrokken geweest bij mechanotransductie bij focale verklevingen en mechanosensitive migration4. De dynamische instabiliteit die MT-plus einddynamica kenmerkt, bestaat uit herhaalde fasen van polymerisatie (groei) en depolymerisatie (krimp), die worden gecontroleerd door een overvloed aan microtubule-bindende eiwitten en intracellulaire signaleringscascades, zoals die worden geregeld door RHO-GTPases 5,6,7. De rol van het MT-netwerk in celmigratie en invasie heeft het onderzoek naar MT-dynamiek tot een belangrijk element gemaakt om de mechanismen van immuuncel homing, wondgenezing en kankerinvasie beter te begrijpen.
Het vermogen van kankercellen om te ontsnappen aan de primaire tumorkern, zich te verspreiden in de weefsels en secundaire tumoren te genereren, is een cruciale stap in het voorkomen van wereldwijd succes in de oorlog tegen kanker die 50 jaar geleden 8,9 werd verklaard. Een van de grootste obstakels is het begrijpen hoe kankercellen actief het weefsel binnendringen. Belangrijke invasiemechanismen vertrouwen op dezelfde principes als die voor niet-tumorachtige celmigratie10. Er zijn echter specifieke kenmerken van kankercelmigratie naar vorengekomen 11, waardoor de behoefte aan een betere karakterisering van dit type migratie is ontstaan. In het bijzonder, omdat de tumormicro-omgeving verschijnt als een belangrijke speler in kankerprogressie12, is het observeren en analyseren van kankercelinvasie in een relevante fysiologische context essentieel om de mechanismen van kankercelverspreiding te ontrafelen.
MT’s staan centraal in de progressie van kanker, om zowel proliferatie als invasie in stand te houden. Nauwkeurige analyse van MT-dynamica in situ kan helpen bij het identificeren van MT-veranderende agentia (MTA) in beide processen. MT-dynamiek varieert drastisch bij een verandering in de omgeving. In vitro voorkomt behandeling met MT-destabiliserende middelen zoals nocodazol de vorming van celuitsteeksels wanneer cellen zijn ingebed in gels in 3D, terwijl het weinig effect heeft op 2D-celmigratie13,14. Hoewel technisch uitdagend, maakt vooruitgang in intravitale beeldvorming in vivo analyse van MT-dynamiek tijdens invasie van kankercellen mogelijk. De observatie van MT’s in subcutaan xenogetransplanteerde fibrosarcoomcellen bij muizen onthulde bijvoorbeeld dat tumor-geassocieerde macrofagen de MT-dynamiek in tumorcellen beïnvloeden15. Deze muismodellen omvatten echter uitgebreide chirurgische procedures en blijven onbevredigend voor minder toegankelijke kankers, zoals de zeer invasieve hersentumor GBM.
Ondanks een sombere gemiddelde overlevingstijd van15 maanden 16, is er weinig bekend over de verspreidingswijze van GBM in het hersenparenchym of de belangrijkste moleculaire elementen die GBM-celinvasie in het hersenweefsel ondersteunen. Verbetering van het muis orthotopisch xenograft (PDX) model en de oprichting van schedelvensters boden nieuwe perspectieven voor GBM celinvasiestudies17,18. Vanwege de suboptimale beeldvormingskwaliteit heeft dit model echter meestal longitudinale beeldvorming van oppervlakkige xenografts mogelijk gemaakt en is het tot nu toe niet met succes gebruikt om subcellulaire beeldvorming van cytoskeleteiwitten te bestuderen. Bovendien zijn in de nasleep van het “3Rs” -bevel om het gebruik van knaagdieren te verminderen en te vervangen door lagere gewervelde dieren, alternatieve modellen opgesteld.
Gebruikmakend van de primitieve immuniteit waargenomen bij zebravis (Danio rerio) larven, werd orthotopische injectie van GBM-cellen in het visbrein ontwikkeld 19,20,21. Injectie in de buurt van de ventrikels in de zich ontwikkelende middenhersenenvatvatting het grootste deel van de menselijke GBM-pathofysiologie21, en hetzelfde voorkeurspatroon van GBM-invasie als bij menselijke co-optie wordt waargenomen22. Dankzij de transparantie van de vislarven maakt dit model de visualisatie mogelijk van GBM-cellen die de hersenen binnendringen vanuit de peri-ventriculaire gebieden waar de meeste GBM’s worden verondersteld te ontstaan23.
Omdat MT’s essentieel zijn voor GBM-celinvasie in vitro24,25, is een betere karakterisering van MT-dynamica en de identificatie van belangrijke regulatoren tijdens celinvasie nodig. Tot op heden hebben de gegevens die zijn gegenereerd met het orthotopische model van zebravissen echter geen subcellulaire analyse van MT-dynamiek tijdens het invasieproces opgenomen. Dit artikel biedt een protocol om MT-dynamiek in vivo te bestuderen en de rol ervan tijdens de invasie van hersenkanker te bepalen. Na stabiele microtubule-etikettering worden GBM-cellen micro geïnjecteerd met 3 dpf in de hersenen van zebravislarven en in realtime in beeld gebracht met een hoge spatio-temporele resolutie tijdens hun progressie in het hersenweefsel. Live beeldvorming van fluorescerende MT’s maakt de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van MT plus-end dynamica mogelijk. Bovendien maakt dit model het mogelijk om het effect van MTA’s op MT-dynamica en op de invasieve eigenschappen van GBM-cellen in realtime te beoordelen. Dit relatief niet-invasieve protocol in combinatie met een groot aantal larven dat tegelijkertijd wordt behandeld en het gemak van medicijntoepassing (in het viswater) maakt het model een aanwinst voor preklinisch testen.
Het in beeld brengen van tumor xenografts met eencellige resolutie zal waarschijnlijk een onmisbaar hulpmiddel worden om ons begrip van GBM-biologie te verbeteren. Live beeldvorming in PDX-modellen van muizen heeft geleid tot waardevolle ontdekkingen over hoe GBM collectief het hersenweefsel binnendringt18. Tot op heden is de spatiotemporale resolutie echter niet hoog genoeg om de dynamiek van eiwitten die de GBM-invasie beheersen te onthullen. We redeneerden dat door de orthotopische engrafting v…
The authors have nothing to disclose.
We zijn Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrijk) en zijn laboratorium, in het bijzonder Valérie Briolat, en Emma Colucci-Guyon zeer dankbaar voor het leveren van de zebravislijnen en de plastic mal voor micro-injectieplaten, en voor hun waardevolle expertise over experimentele procedures voor zebravissen. We bedanken dankbaar de UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, ondersteund door het Franse nationale onderzoeksbureau France BioImaging, en ANR-10-INBS-04; Investeringen voor de toekomst). Dit werk werd ondersteund door de Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), het Centre National de la Recherche Scientifique, en Institut Pasteur en door de gulle giften van mevrouw Marguerite MICHEL en de heer Porquet.
Glioblastoma cell culture | |||
Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
Lenitivirus production | |||
BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
Cell passaging and staining | |||
dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
Zebrafish husbandry | |||
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
Xenotransplantation | |||
24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
Intravital Imaging | |||
3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
Drug Treatment | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
Image Analysis | |||
Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |