Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.
CRISPR / Cas9, çeşitli genetik mutasyonları düzeltmek için yaygın olarak benimsenen çok yönlü ve verimli bir gen düzenleme aracıdır. Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC’ler) in vitro gen manipülasyonunun fizibilitesi, HSPC’leri gen tedavisi için ideal bir hedef hücre haline getirmektedir. Bununla birlikte, HSPC’ler ex vivo kültürde engraftment ve multilineage repopulasyon potansiyellerini orta derecede kaybederler. Bu çalışmada, HSPC engraftmanını geliştiren ve in vivo olarak artan sayıda gen modifiye hücre üreten ideal kültür koşulları tanımlanmıştır. Mevcut rapor, kültür ortamının türü, benzersiz küçük moleküllü kokteyl takviyesi, sitokin konsantrasyonu, hücre kültürü plakaları ve kültür yoğunluğu dahil olmak üzere optimize edilmiş in vitro kültür koşullarını göstermektedir. Buna ek olarak, optimize edilmiş bir HSPC gen düzenleme prosedürü, gen düzenleme olaylarının doğrulanması ile birlikte sağlanır. İn vivo doğrulama için, fare alıcılarında gen düzenlenmiş HSPC’lerin infüzyonu ve engraftman sonrası analizi görüntülenir. Sonuçlar, kültür sisteminin fonksiyonel HSC’lerin sıklığını in vitro olarak arttırdığını ve gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanmasını sağladığını göstermiştir.
Allojenik transplantasyon ortamlarında insan lökosit antijeni (HLA) ile eşleşen donörlere erişilememesi ve çok yönlü ve güvenli genetik mühendisliği araçlarının hızla geliştirilmesi, otolog hematopoetik kök hücre transplantasyonunu (HKHN) kalıtsal kan hastalıkları için iyileştirici bir tedavi stratejisi haline getirmektedir 1,2. Otolog hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) gen tedavisi, hastaların HSPC’lerinin toplanmasını, genetik manipülasyonu, hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesini ve gen düzeltilmiş HSPC’lerin hastaya transplantasyonunu içerir 3,4. Bununla birlikte, gen tedavisinin başarılı sonucu, nakledilebilir gen modifiye greftin kalitesine bağlıdır. HSPC’lerin gen manipülasyon adımları ve ex vivo kültürü, uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC’ler) sıklığını azaltarak greft kalitesini etkiler ve büyük dozlarda gen ile manipüle edilmiş HSPC’lerininfüzyonunu gerektirir 2,5,6.
SR1 ve UM171 de dahil olmak üzere birkaç küçük molekül şu anda kordon kanı HSPC’lerini 7,8 oranında genişletmek için kullanılmaktadır. Yetişkin HSPC’ler için, mobilizasyonda elde edilen daha yüksek hücre verimi nedeniyle, sağlam genleşme gerekli değildir. Bununla birlikte, ex vivo kültürde izole HSPC’lerin sapını korumak, gen terapisi uygulamaları için çok önemlidir. Bu nedenle, hematopoetik kök hücrelerin (HSC’ler) kültür zenginleştirilmesine odaklanan bir yaklaşım, küçük moleküllerin bir kombinasyonu kullanılarak geliştirilmiştir: Resveratrol, UM729 ve SR1 (RUS)7. Optimize edilmiş HSPC kültür koşulları, HSC’lerin zenginleşmesini teşvik eder, bu da gen modifiye HSC’lerin in vivo sıklığının artmasına neden olur ve yüksek dozlarda HSPC’leri manipüle eden gen ihtiyacını azaltır ve uygun maliyetli gen terapisi yaklaşımlarını kolaylaştırır8.
Burada, HSPC’lerin kültürü için kapsamlı bir protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo infüzyonu ve analizi ile birlikte açıklanmaktadır.
HSPC gen tedavisinin başarılı sonucu, ağırlıklı olarak greftteki engraflanabilir HSC’lerin kalitesine ve miktarına bağlıdır. Bununla birlikte, HSC’lerin fonksiyonel özellikleri, gen manipülasyon prosedürü ile ilişkili in vitro kültür ve toksisite de dahil olmak üzere, gen terapisi ürünlerinin hazırlık aşamasında oldukça etkilenir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ex vivo kültürde CD34 + CD133 + CD90 + HSC’lerin kökünü koruyan ideal HSPC<…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, CSCR’nin akış sitometri tesisinin ve hayvan tesisinin personelini kabul etmek istemektedir. A. C. ICMR-SSF bursu, K. V. K. DST-INSPIRE bursu ve P. B. CSIR-JRF bursu tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir (hibe no. BT/PR26901/MED/31/377/2017 ve BT/PR31616/MED/31/408/2019)
4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
DMSO | MPBIO | 219605590 | |
DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
Infrared lamp | MURPHY | – | |
Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
Ketamine | KETMIN 50 | – | |
Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
sgRNA | SYNTHEGO | - | |
SPINWIN | TARSON | 1020 | |
StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |