הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה להדמיית כליות תלת-ממדית (3D). טכניקה זו יכולה להציע פרספקטיבות מקרוסקופיות בפתולוגיה של הכליות, מה שמוביל לתגליות ביולוגיות חדשות.
למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית סיפקה מידע רב על מיקרו-מבנה הכליות, היה קשה לדעת את המבנה המדויק של כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, צינורות איסוף, גלומרולי ועצבים סימפתטיים בכליה בשל היעדר מידע תלת מימדי (3D). סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על המשוכה הגדולה הזו. ניתן לנתח תאים מרובים באיבר שלם ברזולוציה של תא בודד על ידי שילוב של ניקוי רקמות וטכניקת הדמיה תלת-ממדית. עם זאת, שיטות תיוג תאים להדמיית איברים שלמים עדיין אינן מפותחות. בפרט, צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. הפרוטוקול הנוכחי פיתח כתמי כליה של עכברים שלמים להדמיה תלת-ממדית בשיטת ניקוי הרקמות CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף ואנליזה חישובית). הפרוטוקול איפשר לדמיין ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה וגלומרולאומגהליה בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית מנקודת מבט מקיפה. לפיכך, טכניקה זו יכולה להוביל לתגליות חדשות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית.
הכליה מורכבת מאוכלוסיות תאים שונות. למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית נותנת לנו מידע רב על המיקרו-סביבה של הכליות, יש צורך בהדמיה תלת-ממדית (3D) כדי להבין במדויק את ההצלבה הבין-תאית במהלך התקדמות מחלת הכליות. בעבר, היה צורך לבצע מספר עצום של חתכים סדרתיים ושחזור תמונה עבור הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם1. עם זאת, שיטה זו דרשה מאמץ רב מדי והיו לה בעיות מבחינת יכולת השכפול.
סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על מכשולזה 2,3. אטימות הרקמות נובעת בעיקר מפיזור וספיגת אור מכיוון שכל איבר מורכב מחומרים שונים, כולל מים, חלבון ושומנים. לפיכך, האסטרטגיה הבסיסית של ניקוי רקמות היא החלפת מים ושומנים ברקמות עם מקדם שבירה (RI) תואם ריאגנטים בעלי תכונות אופטיות זהות לאלה של חלבונים4. על מנת לצפות בדגימה שקופה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור שימושית5. לוחות אור מאירים את הדגימה השקופה מהצד, ואותות עירור נרכשים דרך העדשה האובייקטיבית הממוקמת במצב אנכי6. מיקרוסקופיה זו מקבלת מידע חתך רוחב במטאטא אחד, השונה מהמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית הקונפוקלית או הרב-פוטונית. לכן, הוא יכול לרכוש במהירות z-stack תמונות עם רמה נמוכה של photobleaching.
קוקטיילים ברורים ללא הפרעה של דימות מוח/גוף ואנליזה חישובית (CUBIC) היא אחת משיטות ניקוי הרקמות המאפשרת הדמיה של איברים שלמים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור 2,7,8. מכתים אימונופלואורסצנטיים מעוקבים ושלמים ממוטבים במחקר הנוכחי כדי לדמיין מבנים תלת-ממדיים של כליות עכברים 9,10,11. באמצעות שיטת צביעה זו, השינוי בעצבים סימפתטיים כלייתיים הוא הדמיה לאחר פגיעה איסכמיה-reperfusion 9,10 ו glomerulomegaly בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית 11, כמו גם כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, ואיסוף צינורות בכליה שלמה9.
הפרוטוקול הנוכחי איפשר הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות של מבנים שונים כגון עצבים סימפתטיים, צינורות איסוף, עורקים, צינוריות פרוקסימליות וגלומרולי 9,10,11. שיטת צביעה זו הציעה תצפית מקרוסקופית והובילה לתגליות ביולוגיות חדשות, על ידי הדמיה של …
The authors have nothing to disclose.
חלק מעבודה זו נערך בשיתוף פעולה עם פרופ’ הירוקי ר. אואדה (אוניברסיטת טוקיו), פרופ’ אטסואו א. סוסאקי (אוניברסיטת ג’ונטנדו), פרופ’ טטסוהירו טאנאקה (אוניברסיטת טוהוקו), פרופ’ מסאפומי פוקגאווה, ד”ר טקהיקו ואדה וד”ר הירוטאקה קומבה (אוניברסיטת טוקאי).
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |