Le présent protocole décrit une méthode de nettoyage tissulaire et une coloration immunofluorescente à montage entier pour l’imagerie rénale tridimensionnelle (3D). Cette technique peut offrir des perspectives macroscopiques en pathologie rénale, conduisant à de nouvelles découvertes biologiques.
Bien que la pathologie conventionnelle fournisse de nombreuses informations sur la microstructure rénale, il était difficile de connaître la structure précise des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux, des canaux collecteurs, des glomérules et des nerfs sympathiques dans le rein en raison du manque d’informations tridimensionnelles (3D). La compensation optique est une bonne stratégie pour surmonter ce gros obstacle. Plusieurs cellules d’un organe entier peuvent être analysées à une résolution unicellulaire en combinant la clairance tissulaire et la technique d’imagerie 3D. Cependant, les méthodes de marquage cellulaire pour l’imagerie des organes entiers restent sous-développées. En particulier, la coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Le présent protocole a développé une coloration rénale de souris à montage entier pour l’imagerie 3D avec la méthode de nettoyage tissulaire CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Le protocole a permis de visualiser la dénervation sympathique rénale après une lésion d’ischémie-reperfusion et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique d’un point de vue global. Ainsi, cette technique peut mener à de nouvelles découvertes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique.
Le rein est composé de diverses populations cellulaires. Bien que la pathologie conventionnelle nous donne beaucoup d’informations sur le microenvironnement rénal, l’imagerie tridimensionnelle (3D) est nécessaire pour comprendre précisément la diaphonie intercellulaire au cours de la progression de la maladie rénale. Dans le passé, un grand nombre de coupes en série et de reconstruction d’images devaient être effectuées pour l’imagerie 3D de l’organe entier1. Cependant, cette méthode nécessitait trop d’efforts et présentait des problèmes en termes de reproductibilité.
Le défrichage optique est une bonne stratégie pour surmonter cet obstacle 2,3. L’opacité tissulaire est principalement due à la diffusion et à l’absorption de la lumière, car chaque organe est constitué de diverses substances, notamment de l’eau, des protéines et des lipides. Ainsi, la stratégie de base de la clairissance tissulaire consiste à remplacer l’eau et les lipides dans les tissus par des réactifs correspondant à l’indice de réfraction (IR) qui ont les mêmes propriétés optiques que les protéines4. Afin d’observer un échantillon transparent, une microscopie fluorescente à feuille de lumière est utile5. Des feuilles lumineuses éclairent l’échantillon transparent de côté, et les signaux d’excitation sont acquis à travers la lentille de l’objectif située en position verticale6. Cette microscopie permet d’obtenir des informations de coupe transversale en un seul balayage, ce qui est différent de la microscopie confocale ou multiphotonique. Ainsi, il peut rapidement acquérir des images z-stack avec un faible niveau de photoblanchiment.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) est l’une des méthodes de nettoyage des tissus qui permet l’imagerie d’organes entiers par microscopie fluorescenteà feuille de lumière 2,7,8. La coloration immunofluorescente CUBIC et à montage entier est optimisée dans la présente étude pour visualiser les structures 3D des reinsde souris 9,10,11. En utilisant cette méthode de coloration à montage entier, l’altération des nerfs sympathiques rénaux est visualisée après une lésion d’ischémie-reperfusion 9,10 et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique 11, ainsi que des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux et des canaux collecteurs dans un rein entier 9.
Le protocole actuel a permis l’imagerie 3D du rein entier de diverses structures telles que les nerfs sympathiques, les canaux collecteurs, les artères, les tubules proximaux et les glomérules 9,10,11. Cette méthode de coloration offrait une observation macroscopique et conduisait à de nouvelles découvertes biologiques, en visualisant l’altération des nerfs sympathiques rénaux après une lésion</sup…
The authors have nothing to disclose.
Une partie de ce travail a été menée en collaboration avec le professeur Hiroki R. Ueda (Université de Tokyo), le professeur Etsuo A. Susaki (Université Juntendo), le professeur Tetsuhiro Tanaka (Université de Tohoku), le professeur Masafumi Fukagawa, le Dr Takehiko Wada et le Dr Hirotaka Komaba (Université de Tokai).
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |