여기에서는 1차 환자 검체 또는 환자 유래 세포 배양에서 교모세포종(GBM) 오가노이드를 생성하고 성숙할 때까지 유지하는 방법을 설명합니다. 이러한 GBM 오가노이드는 표현형적으로 다양한 세포 집단을 포함하고 생체 외 종양 미세 환경을 재현합니다.
교모세포종(GBM)은 가장 흔하게 발생하는 원발성 악성 뇌암으로 예후가 매우 좋지 않습니다. 종양 내 세포 및 분자 다양성뿐만 아니라 종양 미세 환경 간의 복잡한 상호 작용은 효과적인 치료법을 찾는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 전통적인 부착 또는 구 배양 방법은 이러한 복잡성을 가릴 수 있는 반면, 3차원 오가노이드 배양은 지역 미세 환경 구배를 요약할 수 있습니다. 오가노이드는 환자 종양 구조를 더 잘 모방하고 표현형적으로 다양한 세포 집단을 포함하며 중간 처리량 실험에 사용할 수 있는 3차원 GBM 배양 방법입니다. 3차원 오가노이드 배양은 기존 배양에 비해 더 힘들고 시간이 많이 걸리지만 고유한 이점을 제공하며 현재 체외 시스템과 생체 내 시스템 간의 격차를 해소하는 역할을 할 수 있습니다. 오가노이드는 종양 행동과 내성 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 암 생물학자들의 무기고에서 귀중한 도구로 자리 잡았으며 그 응용 분야는 계속 증가하고 있습니다. 여기에서는 GBM 오가노이드를 생성하고 유지하는 방법에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 냉동 및 파라핀 임베딩 기술을 모두 사용하여 오가노이드 샘플 임베딩 및 절편을 수행하는 방법에 대한 지침, 오가노이드 절편에 대한 면역조직화학 및 면역형광 프로토콜에 대한 권장 사항, 총 오가노이드 세포 생존율 측정도 모두 설명되어 있습니다.
교모세포종(GBM)은 진단15개월 후 약 15개월의 암울한 예후를 보이는 가장 흔하게 발생하는 원발성 뇌종양입니다. 전임상 연구에서 효과적인 치료법은 종종 환자 2,3에서 효과가 없을 수 있습니다. 열악한 임상 반응은 GBM의 미세 환경 적 이질성과 복잡한 종양 내 상호 작용을 포함한 많은 요인에 기인합니다. 이들은 전통적인 부착 또는 구체 배양 방법으로 실험실 환경에서 재현하기 어려울 수 있습니다4. GBM 내에자가 재생 암 줄기 세포 (CSC)의 하위 집합이 존재하는 것도 이러한 복잡성에 기여할 수 있습니다 5,6. CSC는 종양 전파에 중요하며 활성 혈관 신생, 암 침윤 및 방사선 7,8,9를 포함한 치료법에 대한 내성을 촉진하여 종양 성장을 유지합니다. CSC는 종양 전체에 균일하게 분포하지 않고 오히려 혈관 주위 틈새 및 회음부 영역을 포함한 특정 미세 환경 내에서 풍부하며, 이는 각각 세포 상태10,11,12,13,14의 뚜렷한 분자 조절을 제공합니다. CSC는 미세 환경 신호의 수동적 수신자가 아니라 대신 자신의 미세 환경을 리모델링 할 수있는 능력을 가지고 있습니다 7,15,16. CSC의 미세 환경은 영양 부족, pH 및 저산소증17,18,19,20과 같은 압력에 반응하여 줄기 세포 상태의 유지를 촉진 할 수 있으며, 이는 모델 시스템에서 이러한 조건의 중요성을 시사합니다. 따라서 종양 내의 다양한 세포 미세 환경의 요약은 치료 내성을 이해하고 새로운 치료법을 식별하는 데 중요합니다.
3 차원 문화는 최근 몇 년 동안 인기가 높아졌습니다21,22. 오가노이드는 다른 유형의 암에서 사용되어 왔으며, 세포를 오가노이드로 유지하는 주요 목표는 이질적인 세포 집단(그 중 다수는 일반적으로 보다 균질한 구 배양에서 경쟁할 수 있음)의 성장과 유전적 특이성을 가진 지역 종양 미세환경으로 간주되는 공간적 다양성을 허용하는 것입니다.4,23,24,25,26 . 암세포의 3 차원 배양을위한 많은 방법이 있으며, 각각 장점과 단점27,28,29가 있습니다. 오가노이드 배양은 전통적인 부착 또는 구 배양을 대체하기 위한 것이 아닙니다. 세포 미세 환경과 종양 세포 반응 사이의 상호 작용이 중요한 특정 질문이있을 때 2 차원 방법에 대한 보완 기술로 가장 잘 사용됩니다.
이 기사에서는 1차 환자 샘플 또는 환자 유래 배양에서 GBM 오가노이드를 생성하는 신뢰할 수 있고 반복 가능한 방법을 설명합니다. 우리는 3차원 오가노이드 배양을 위한 두 가지 다른 목표를 다룹니다: (1) 균일성에 관계없이 최대 생착 잠재력을 가진 1차 환자 조직에서 오가노이드를 확립하거나 (2) 보다 정량적인 실험 사용을 위해 균일한 오가노이드를 성장시킵니다. 1차 검체를 오가노이드로 설정할 때 초기 배양을 확립하기 위해 최대 세포 수와 유형을 유지하는 것이 우선이기 때문에 단일 세포를 필터링하거나 세포를 계수할 필요가 없습니다. 그러나 비교 실험을 위해 오가노이드를 성장시킬 때는 실험 일관성을 위해 복제 오가노이드를 비교할 수 있도록 단일 세포 여과 및 세포 계수가 필요합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양을 확립하고 균일한 오가노이드를 만드는 방법뿐만 아니라 오가노이드를 매립 및 보존하기 위한 정제된 방법과 면역조직화학, 면역형광법 및 GBM 오가노이드의 총 세포 생존율 평가를 포함한 표준 세포 배양 실험을 자세히 설명합니다.
GBM 오가노이드는 더 큰 세포 및 미세 환경 이질성 4,22,30을 포함하는 전통적인 영역에 대한 보완적인 배양 방법입니다. 더 많은 시간과 자원 집약적이지만 오가노이드 배양은 종양 내 행동 및 약물 내성 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
GBM은 CSC 5,31의 인구에 의해 구동되며, 이러한 방법은이 CSC 인구의 지속적인 성장과 자체 갱신을 허용하기 위해 개발되었습니다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)는 줄기 세포 유지 및 성장을 향상시키고 활성 수용체 티로신 키나제 (RTK) 신호를 제공하는 것으로 알려져 있습니다. GBM 종양 내에서 이질적인 세포 집단과 뚜렷한 종양 미세 환경의 형성은 CSC 행동을 지원하는 데 의존합니다. lrECM의 선택은 라미닌이 풍부한 뇌 환경을 모방하고 오가노이드 배양의 세포가 침입에 의해 자가 조직화되고 이동하도록 지원합니다. 일부 그룹은 lrECM 또는 EGF/FGF 농축 배지24,28을 사용하지 않고 오가노이드 배양을 확립했으며, 이는 이 배양 방법의 보다 시간 효율적인 방식과 성장을 촉진하기 위한 발암성 신호전달의 더 강력한 선택을 제공할 수 있지만, 이러한 방법은 오가노이드의 세포 이질성을 가장 잘 확립하기 위해 전줄기세포 환경을 최적화하기 위해 선택되었습니다. 대뇌 오가노이드와 GBM 오가노이드 모두 이전 문헌 21,32,33에서 lrECM으로 만들어졌습니다. 오가노이드 내에서 발견되는 종양 집단과 공간적 변화에 관한 데이터를 확립했지만, 오가노이드 내의 비종양 집단과 원래 환자 표본에서 생존하는 기간에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 특정 IHC 염색(예: CD45)은 이러한 데이터를 제공할 수 있으며 향후 오가노이드에 대한 흥미로운 연구 포인트가 될 수 있습니다.
오가노이드 배양의 용도를 아는 것은 적절한 방법을 선택하는 데 중요합니다. 1차 표본에서 오가노이드를 확립하는 것과 특정 실험을 위해 균일한 오가노이드를 성장시키는 것은 약간 다른 절차를 거칩니다. 오가노이드가 어떻게 성숙하고 lrECM 스캐폴드를 시각적으로 채우는지에 대한 이해는 오가노이드 배양에 적절한 시간과 자원을 할당할 수 있는 데 중요합니다. 오가노이드에 있는 세포의 희소 영역은 천천히 확장되고 성장하여 lrECM을 채우며, 이는 표본의 행동에 따라 2-8주가 소요될 수 있습니다. 이 성장률은 각 표본에 다소 내재되어 있습니다. 그것은 유기체의 다른 배치에 걸쳐 보존되며 구체 성장의 상대적 속도와 상당히 일치합니다. 오가노이드는 1년 이상 유지될 수 있으며 마우스로의 이종이식에서 종양 형성 능력을 유지합니다. 그러나 실험실 자원(재료 및 시간 모두)을 낭비하지 않도록 뚜렷한 목적으로 재배하는 것이 좋습니다4. 오가노이드 성장은 여러 웰 크기 및 형식으로 테스트되었으며, 10cm 플레이트가 최적의 세포 생존율을 유지하기 위한 이상적인 설정이며, 그 다음에 웰당 3개의 오가노이드가 있는 6웰 플레이트가 뒤따른다는 것을 보여줍니다(34). 오가노이드는 2차원 배양 제품에 비해 더 많은 배지를 소비하며 더 작은 웰 형식을 사용하면 적절한 유지 관리가 이루어지지 않습니다. 예를 들어, 96웰 포맷 플레이트의 한 웰은 오가노이드 성장을 지속하기에 오가노이드의 크기에 비해 충분한 공간이나 배지 부피를 갖지 않습니다.
유기체가 확립함에 따라 관찰력은 성공을 높이는 데 중요합니다. 처음에 오가노이드는 미디어를 천천히 소비하지만 밀도가 높아지고 성숙해짐에 따라 미디어를 더 빨리 소비합니다. 미디어에 페놀 레드를 추가하면 미디어 소비의 지표 역할을 할 수 있습니다. 배지가 더 노란색이면 더 많은 양의 배지를 교환하거나, 플레이트의 총 배지 양을 늘리거나, 성장을 따라잡기 위해 여러 세포 배양 플레이트에 오가노이드를 나누거나, 실험 일정을 조정하는 등 공급 패턴을 조정하라는 메시지가 표시될 수 있습니다.
여러 면에서 오가노이드는 암 연구를 수행하는 비효율적인 방법입니다. 그들은 오랜 시간 척도를 포함하며 GBM 구 문화에 비해 비싸고 자원이 많이 듭니다. 그러나 세포 및 미세 환경 다양성을 재현하기위한 대체 방법 인 환자 유래 이종 이식편과 비교할 때 더 간단하고 저렴하며 제어 할 수 있습니다. 오가노이드를 가장 잘 사용할 때를 선택하는 것은 암 연구자에게 중요합니다. 그들은 전통적인 구체 또는 부착 문화를 대체하기위한 것이 아니며 이종 이식 모델을 대체하기위한 것이 아닙니다. 오가노이드는 올바른 과학적 질문에 적용될 때 이 두 시스템의 이점을 결합할 수 있으며 그렇지 않으면 숨겨져 있을 종양 세포 생물학을 관찰할 수 있습니다. 과학계는 오가노이드가 제공하는 학습 기회를 이해하기 시작했을 뿐이지만, GBM의 복잡한 생물학을 이해하는 데 미래에 귀중한 도구가 될 것임은 분명합니다.
The authors have nothing to disclose.
귀중한 조언과 지속적인 지원에 대해 Justin Lathia 박사에게 감사드립니다. 또한 카트리나 파이프, 리사 월리스, 마야 카미의 탁월한 기술 지원에 감사드립니다.
3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |