在这里,我们描述了一种从主要患者标本或患者来源的细胞培养物中生成胶质母细胞瘤(GBM)类器官并将其维持至成熟的方法。这些GBM类器官含有表型不同的细胞群,并在 体外重建肿瘤微环境。
胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性恶性脑癌,预后极差。肿瘤内细胞和分子多样性,以及肿瘤微环境之间的复杂相互作用,可能使寻找有效的治疗方法成为一项挑战。传统的贴壁或球体培养方法可以掩盖这种复杂性,而三维类器官培养可以概括区域微环境梯度。类器官是一种三维GBM培养方法,可更好地模拟患者肿瘤结构,包含表型多样化的细胞群,可用于中等通量实验。虽然与传统培养相比,三维类器官培养更加费力和耗时,但它提供了独特的好处,可以弥合当前 体外 和 体内 系统之间的差距。类器官已成为癌症生物学家武器库中的宝贵工具,可以更好地了解肿瘤行为和耐药机制,并且其应用只会继续增长。这里详细介绍了生成和维护GBM类器官的方法。还介绍了如何使用冷冻和石蜡包埋技术进行类器官样品包埋和切片的说明,以及类器官切片的免疫组织化学和免疫荧光方案的建议,以及总类器官细胞活力的测量。
胶质母细胞瘤 (GBM) 是最常见的原发性脑肿瘤,诊断后约 15 个月。在临床前研究中有效的治疗通常对患者效果不佳2,3。临床反应差归因于许多因素,包括GBM的微环境异质性和复杂的肿瘤内相互作用。这些很难在实验室环境中使用传统的贴壁或球体培养方法重现4。GBM中存在一部分自我更新的癌症干细胞(CSC)也可能导致这种复杂性5,6。CSC 对肿瘤增殖至关重要,并通过促进活性血管生成、癌症侵袭和对包括辐射在内的治疗的耐药性来维持肿瘤生长7,8,9。CSCs并非均匀分布在整个肿瘤中,而是富集在特定微环境中,包括血管周围生态位和会坏死区域,每个区域都为其细胞状态提供不同的分子调控10,11,12,13,14。CSC不是微环境线索的被动接受者,而是具有重塑自身微环境的能力7,15,16。CSC的微环境可以促进干细胞状态的维持,以响应营养稀缺,pH和缺氧等压力17,18,19,20,这表明这些条件在模型系统中的重要性。因此,概述肿瘤内不同的细胞微环境对于理解治疗耐药性和确定新疗法至关重要。
三维文化近年来越来越受欢迎21,22。类器官已被用于其他类型的癌症,维持细胞作为类器官的主要目标是允许异质细胞群的生长(其中许多细胞群通常在更均匀的球体培养中可能被竞争所击败)和空间多样性,被视为具有遗传特异性的区域肿瘤微环境4,23,24,25,26.癌细胞的三维培养方法有很多种,每种方法都有优点和缺点27,28,29。类器官培养不能替代传统的贴壁或球状培养。当存在细胞微环境与肿瘤细胞反应之间的相互作用至关重要的特定问题时,最好将其用作二维方法的补充技术。
本文介绍了从原发性患者样本或患者来源的培养物中生成GBM类器官的可靠且可重复的方法。我们解决了三维类器官培养的两个不同目标:(1)从原发性患者组织中建立类器官,无论均匀性如何,都具有最大的植入潜力,或(2)生长均匀类器官以进行更定量的实验使用。当将原代标本建立为类器官时,无需过滤单个细胞或计数细胞,因为保持最大细胞数量和类型以建立初始培养物是当务之急。然而,当为比较实验培养类器官时,需要单细胞过滤和细胞计数,以确保重复类器官具有实验一致性的可比性。该协议详细介绍了如何建立类器官培养物并创建均匀的类器官,以及包埋和保存类器官和标准细胞培养实验的改进方法,包括免疫组织化学,免疫荧光和GBM类器官中总细胞活力的评估。
GBM类器官是传统球体的互补培养方法,具有更大的细胞和微环境异质性4,22,30。虽然需要花费更多的时间和资源,但类器官培养可以为肿瘤内行为和耐药机制提供有价值的见解。
GBM由CSCs的5,31种群驱动,这些方法的开发是为了允许CSC种群的持续增长和自我更新。已知表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)可增强干细胞的维持和生长,并提供活性受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导。GBM肿瘤内异质细胞群和不同肿瘤微环境的形成依赖于支持CSC行为。lrECM的选择模仿富含层粘连蛋白的大脑环境,并支持类器官培养中的细胞通过侵袭进行自我组织和迁移。尽管一些小组已经在不使用lrECM或EGF / FGF富集培养基24,28的情况下建立了类器官培养,这可能为这种培养方法提供了更省时的方式,并且更能选择致癌信号来驱动生长,但选择这些方法来优化前干细胞环境以最好地建立类器官的细胞异质性。脑类器官和GBM类器官在之前的文献中均已用lrECM制成21,32,33。尽管我们已经建立了有关类器官中发现的肿瘤群体和空间变异的数据,但对类器官中的非肿瘤群体以及它们从原始患者标本中存活多长时间知之甚少。某些IHC染色剂(如CD45)可能会提供这些数据,并且可能是未来类器官的一个有趣的研究点。
了解类器官培养的预期用途对于选择合适的方法非常重要。从原始标本建立类器官与为特定实验生长均匀类器官的程序略有不同。了解类器官如何成熟并在 lrECM 支架中视觉填充对于能够为类器官培养分配适当的时间和资源非常重要。类器官中细胞的稀疏区域将缓慢扩展和生长以填充lrECM,这可能需要2-8周的时间,具体取决于标本的行为。这种生长速度在某种程度上是每个标本固有的;它保存在不同批次的类器官中,并且与球体生长的相对速率相当一致。类器官可以维持1年以上,并在异种移植到小鼠中保持肿瘤形成能力;但是,建议以不同的目的种植它们,以免浪费实验室资源(材料和时间)4。类器官生长已在多种孔大小和形式中进行了测试,并表明 10 cm 板是保持最佳细胞活力的理想设置,其次是每孔34 个类器官的 6 孔板。与二维培养物相比,类器官消耗更多的培养基,并且使用较小的孔格式不会导致适当的维护。例如,相对于类器官的大小,96孔板的一个孔没有足够的空间或培养基体积来维持类器官生长。
正如类器官所确立的那样,观察力对于提高成功率很重要。最初,类器官会缓慢消耗培养基,但随着它们变得更密集和更成熟,它们会更快地消耗培养基。向培养基中添加酚红有助于作为培养基消耗的指标。当培养基更黄时,可能会提示我们调整进料模式,无论是更换更大体积的培养基,增加板中的总培养基量,在多个细胞培养板之间分配类器官以跟上其生长,甚至调整实验的时间线。
在许多方面,类器官是进行癌症研究的低效方式。它们涉及较长的时间尺度,与GBM球体培养相比,价格昂贵且资源密集。然而,与患者来源的异种移植物(一种重建细胞和微环境多样性的替代方法)相比,它们更直接、更便宜且可控。选择何时最好地使用类器官对癌症研究人员很重要。它们不是为了取代传统的领域或追随者文化,也不是为了取代异种移植模式。当类器官应用于正确的科学问题时,可以结合这两种系统的好处,并可能允许我们观察肿瘤细胞生物学,否则这些生物学将保持隐藏。科学界才刚刚开始了解类器官提供的学习机会,但很明显,它们将成为未来理解GBM复杂生物学的宝贵工具。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢Justin Lathia博士的宝贵建议和持续支持。我们还要感谢Katrina Fife,Lisa Wallace和Maya Camhi的出色技术支持。
3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |