Этот протокол описывает методологию генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием трансгенной модели рыбок данио. Адаптация протокола для включения модуляции сигнального пути с использованием фармакологических соединений подробно описана. Была разработана и обсуждается платформа MATLAB для количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации.
Пигментный эпителий сетчатки (RPE) находится в задней части глаза и выполняет функции, необходимые для поддержания здоровья и целостности соседних тканей сетчатки и сосудов. В настоящее время ограниченная репаративная способность RPE млекопитающих, которая ограничена небольшими травмами, препятствует прогрессу в понимании регенеративных процессов RPE in vivo . Здесь представлена подробная методология, облегчающая изучение восстановления RPE in vivo с использованием рыбки данио, модели позвоночных, способной к надежной регенерации тканей. Этот протокол описывает трансгенную нитроредуктазу/метронидазол (NTR/MTZ)-опосредованную парадигму повреждения (rpe65a:nfsB-eGFP), которая приводит к абляции центральных двух третей RPE после 24-часового лечения MTZ с последующим восстановлением тканей. Основное внимание уделяется абляции RPE у личинок рыбок данио, а также изложены методы тестирования влияния фармакологических соединений на регенерацию RPE. Также обсуждается генерация и валидация RpEGEN, скрипта MATLAB, созданного для автоматизации количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации. Помимо активных механизмов восстановления RPE, этот протокол может быть расширен до исследований дегенерации RPE и реакций на травмы, а также влияния повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов, среди других клеточных и молекулярных процессов. Эта система рыбок данио имеет значительные перспективы в выявлении генов, сетей и процессов, которые управляют регенерацией RPE и механизмами, связанными с болезнью RPE, с долгосрочной целью применения этих знаний к системам млекопитающих и, в конечном счете, к терапевтическому развитию.
Методология, описанная в настоящем описании, детализирует протокол генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием личинок рыбок данио. RPE простирается над задней частью глаза и находится между стратифицированными слоями нервной сетчатки и слоем сосудистой системы, составляющим сосудистую оболочку. Трофическая поддержка, поглощение фототоксического света и поддержание белков зрительного цикла являются лишь некоторыми из критических функций, выполняемых RPE, которые необходимы для поддержания здоровья и целостности этих смежных тканей1. Повреждения РПЭ млекопитающих поддаются исправлению, когда поражения небольшие2; однако ущерб, нанесенный более крупными травмами или прогрессирующими дегенеративными заболеваниями, является необратимым. У людей дегенеративные заболевания RPE (например, возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и болезнь Штаргардта) приводят к постоянной потере зрения и, при небольшом количестве доступных вариантов лечения, снижению качества жизни пациента. Ограниченная способность RPE млекопитающих к самовосстановлению создала пробел в знаниях в области регенеративных процессов RPE. Учитывая надежную регенеративную способность рыбок данио во многих различных типах тканей, этот протокол был разработан для создания системы позвоночных in vivo для облегчения исследований внутренне регенерирующего RPE и выявления механизмов, которые управляют этим ответом. Используя парадигму абляции, описанную здесь, канонический сигнальный путь Wnt3, путь mTOR4 и иммунные ответы5 были идентифицированы как критические медиаторы регенерации RPE, вероятно, с перекрывающимися функциями.
В этой парадигме генетической абляции Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 рыбки данио экспрессируют ген нитроредуктазы бактериального происхождения (NTR/nfsB)6, слитый с eGFP под контролем энхансерного элемента RPE, rpe65a7. Абляция достигается путем добавления пролекарства, метронидазола (MTZ), в систему воды, в которой содержатся рыбки данио. Внутриклеточная активация МТЗ нитроредуктазой приводит к сшиванию ДНК и апоптозу в NTR/nfsB-экспрессирующих клетках 8,9. Эта технология была широко использована у рыбок данио для удаления клеток сетчатки 10,11,12,13 и других тканей 8. Вместе эти элементы обеспечивают целенаправленную экспрессию (rpe65a) индуцируемой методологии абляции клеток (NTR/MTZ)8,9 и флуоресцентного маркера (eGFP) для визуализации.
Существуют и другие интересные модели in vivo, которые могут быть использованы для изучения регенеративного потенциала RPE14. Они являются широкими и включают трансдифференциацию RPE-to-retina после ретинэктомии у амфибий, при которой клетки RPE, потерянные при отрастании сетчатки, заменяются15,16; Восстановление РПЭ после травмы у «супер заживляющей» мыши MRL/MpJ17; и экзогенная стимуляция пролиферации RPE в крысиной модели спонтанной RPE и дегенерации сетчатки18, среди прочих. Также были разработаны модели in vitro, такие как взрослые стволовые клетки RPE человека (RPESCs)19. Все эти модели являются ценными инструментами, работающими над выявлением клеточных процессов, связанных с регенерацией RPE (например, пролиферация, дифференциация и т. Д.); тем не менее, рыбка данио уникальна своей способностью к внутреннему восстановлению RPE после абляции.
В то время как методология здесь написана, чтобы сосредоточиться на понимании механизмов, приводящих к регенерации RPE, линия Tg(rpe65a: nfsB-eGFP) и этот протокол генетической абляции могут быть использованы для изучения других клеточных процессов, таких как апоптоз RPE, дегенерация RPE и влияние повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов. Протокол абляции также может быть модифицирован для включения фармакологических манипуляций, что является удобной предварительной стратегией для скрининга интересующих сигнальных путей. Например, было показано, что блокирование канонического пути Wnt с помощью ингибитора ответа Wnt-1 (IWR-1)20 ухудшает регенерацию RPE3. Это было повторено здесь, чтобы провести пользователей через фармакологический эксперимент манипуляции и служить доказательством концепции для проверки сценария MATLAB (RpEGEN), созданного для количественной оценки регенерации RPE на основе восстановления пигментации. Как и трансгенная линия и протокол абляции, скрипты RpEGEN адаптируются и могут быть использованы для количественной оценки других маркеров / клеточных процессов в RPE.
Этот протокол описывает методологию генетической абляции RPE и изучает механизмы дегенерации и регенерации у личиночных рыбок данио. Этот протокол также был успешно выполнен у взрослых рыбок данио3, но с менее обширной характеристикой, поэтому личинки находятся в центре вн…
The authors have nothing to disclose.
Работа, описанная здесь, была поддержана Национальными институтами здравоохранения (RO1-EY29410 для J.M.G и грант NIH CORE P30-EY08098 для департамента офтальмологии); Центр иммунной трансплантации и терапии UPMC (для L.L.L. и J.M.G.); и кафедра офтальмологических исследований Э. Рональда Сальвитти (дж.м.г.). Дополнительная поддержка была получена от стипендии Виганда в области офтальмологии (L.L.L.), Фонда глаз и ушей Питтсбурга и неограниченного гранта от Research to Prevent Blindness, New York, NY. Авторы также хотели бы поблагодарить Аманду Платт за техническую помощь и доктора Хью Хаммера и персонал водных видов спорта за отличную поддержку по уходу за животными.
Lab Material/Equipment | |||
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Software Material | |||
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |