מודל עכברי של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה הנגרמת על ידי חומצה אולאית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל פגיעה ריאתית בעכברים המשתמש בחומצה אולאית כדי לחקות תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). מודל זה מגביר את מתווכי הדלקת על בצקת ומקטין את היענות הריאות. חומצה אולאית משמשת בצורת מלח (oleate) שכן צורה פיזיולוגית זו מונעת את הסיכון של תסחיף.
Abstract
תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) מהווה איום משמעותי על חולים במצב קריטי עם שיעור תמותה גבוה. חשיפה למזהמים, עשן סיגריות, גורמים זיהומיים וחומצות שומן יכולים לגרום ל- ARDS. מודלים של בעלי חיים יכולים לחקות את הפתומנגנון המורכב של ARDS. עם זאת, לכל אחד מהם יש מגבלות. יש לציין כי חומצה אולאית (OA) מוגברת בחולים במצב קריטי עם השפעות מזיקות על הריאה. OA יכול לגרום לפגיעה ריאתית על ידי אמבולי, לשבש רקמות, לשנות pH, ולפגוע בסילוק בצקת. מודל פגיעת ריאות הנגרמת על ידי OA דומה לתכונות שונות של ARDS עם פגיעה באנדותל, חדירות מוגברת של מכתשית, דלקת, היווצרות היאלין בקרום ומוות תאי. כאן, השראת פגיעה ריאתית מתוארת על ידי הזרקת OA (בצורת מלח) ישירות לתוך הריאה ותוך ורידי בעכבר שכן היא הצורה הפיזיולוגית של OA ב pH 7. לפיכך, הזרקת OA בצורת מלח היא מודל מועיל של בעלי חיים לחקר פגיעה ריאתית / ARDS מבלי לגרום לאמבולי או לשנות את ה- pH, ובכך להתקרב למה שקורה בחולים קריטיים.
Introduction
Ashbaugh et al.1, בשנת 1967, תיארו לראשונה את תסמונת המצוקה הנשימתית החריפה (ARDS) ומאז עברו תיקונים מרובים. על פי ההגדרה בברלין, ARDS היא דלקת ריאות המובילה לכשל נשימתי חריף והיפוקסמיה(PaO 2/FiO 2 > 300 מ”מ כספית) עקב חוסר איזון ביחס האוורור לזילוח, נזק מכתשי דו צדדי מפוזר (DAD) וחדירה, משקל ריאות מוגבר ובצקת 2,3. פרנכימה ריאתית היא סביבה תאית מורכבת המורכבת על ידי אפיתל, אנדותל ותאים אחרים. תאים אלה יוצרים מחסומים ומבנים האחראים על חילופי גזים והומאוסטזיס בנאדיות3. התאים הנפוצים ביותר בתוך מחסום האפיתל הם תאים מסוג I (AT1) עם שטח פנים גדול יותר לחילופי גזים וניהול נוזלים באמצעות Na/K-ATPase. כמו כן, תאים מסוג II (AT2) לייצר פעילי שטח, הפחתת מתח פני השטח alveoli4. מתחת, תאי אנדותל יוצרים מחסום חדיר למחצה המפריד בין מחזור הדם הריאתי לבין האינטרסטיציום. תפקידיו כוללים זיהוי גירויים, תיאום תגובות דלקתיות והעברה סלולרית5. תאי האנדותל מווסתים גם את חילוף הגזים, טונוס כלי הדם וקרישה5. לכן, הפרעות בתפקוד האנדותל והאפיתל עלולות להחמיר פנוטיפ פרו-דלקתי, ולגרום נזק לריאות המוביל ל-ARDS5.
התפתחות ARDS קשורה בסיכון לדלקת ריאות חיידקית ונגיפית או לגורמים עקיפים כגון אלח דם לא ריאתי, טראומה, עירויי דם ודלקת לבלב6. תנאים אלה גורמים לשחרור של דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים (PAMPs) ודפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMPs), וגורמים לציטוקינים וכימוקינים מעודדי דלקת כגון TNF-α, IL-1β, IL-6 ו- IL-85. TNF-α קשור לירידה בקדהרין של כלי הדם-אנדותל (VE-cadherin) בהפרעה במחסום האנדותל ובחדירת לויקוציטים לפרנכימת הריאות. נויטרופילים הם התאים הראשונים שנודדים, נמשכים על ידי IL-8 ו- LTB4 5,7,8. נויטרופילים מגבירים עוד יותר את היווצרותם של ציטוקינים מעודדי דלקת, מיני חמצן תגובתי (ROS)9 ומלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs), מה שיוצר נזק נוסף לאנדותל ולאפיתל10. נזק לאפיתל גורם לדלקת ולהפעלה של קולטנים דמויי טול בתאי AT2 ובמקרופאגים תושבים, מה שגורם לשחרור של כימוקינים המושכים תאים דלקתיים לריאות4. כמו כן, ייצור ציטוקינים כמו אינטרפרון-β (INFβ) גורם לקולטנים הגורמים לאפופטוזיס הקשורים ל-TNF (TRAIL), מה שמוביל תאי ATII לאפופטוזיס, מה שפוגע בנוזל וביוניםקלרנס 4. השיבוש במבנה מחסום האנדותל והאפיתל מאפשר זרימה של נוזלים, חלבונים, תאי דם אדומים ולויקוציטים לחלל הנאדיות, וגורם לבצקת. עם בצקת הוקמה, המאמץ הריאתי לשמור על נשימה חילופי גזים משתנה11. היפרקפניה והיפוקסמיה, גורמות למוות תאים ולהפרעה בהובלת נתרן, ומחמירות בצקת בנאדיות עקב יכולת פינוי ירודה10. ל-ARDS יש גם רמות גבוהות של IL-17A, הקשורות לתפקוד לקוי של איברים, אחוז מוגבר של נויטרופילים בנאדיות וחדירות מכתשית9.
בשנים האחרונות חלה התקדמות מתמשכת במחקר על הפתופיזיולוגיה, האפידמיולוגיה והטיפול ב- ARDSבשנים האחרונות 12,13. עם זאת, ARDS היא תסמונת הטרוגנית למרות ההתקדמות במחקר הטיפולי וכתוצאה מכך אוורור מכני ואופטימיזציה של טיפול בנוזלים. לפיכך, עדיין יש צורך בטיפול תרופתי ישיר יעיל יותר10, ומחקרים בבעלי חיים עשויים לסייע בחשיפת מנגנוני ARDS ויעדים להתערבות.
מודלים נוכחיים של ARDS אינם מסוגלים לשכפל באופן מלא את הפתולוגיה. לכן, חוקרים בוחרים לעתים קרובות את המודל שיכול להתאים יותר לאינטרסים שלהם. לדוגמה, מודל השראת ליפופוליסכריד (LPS) משרה ARDS על ידי הלם אנדוטוקסי המופעל בעיקר על ידי TLR414. השראת HCl מחקה שאיפת חומצה, והנזק תלוי נויטרופיל14. מצד שני, מודל הנתרן אולאט הנוכחי גורם נזק לאנדותל המגביר את חדירות כלי הדם ובצקת. יתר על כן, שימוש בנתרן אולאט במקום חומצה אולאית בצורה נוזלית מונע סיכוני תסחיף ושינוי ב- pH15 בדם.
מודלים של בעלי חיים עבור ARDS
מחקרים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים מסייעים להבין את הפתולוגיה והם חיוניים למחקר חדש בטיפולי ARDS. המודל החייתי האידיאלי צריך להיות בעל מאפיינים הדומים למצב הקליני ויכולת שחזור טובה של מנגנוני מחלה עם מאפיינים פתופיזיולוגיים רלוונטיים של כל שלב מחלה, אבולוציה ותיקון14. מספר מודלים של בעלי חיים משמשים להערכת פגיעה ריאתית חריפה ב- ARDS באופן טרום קליני. עם זאת, כמו כל המודלים יש מגבלות, הם לא לשחזר באופן מלא את הפתולוגיה האנושית 6,14,16. ARDS המושרה על ידי חומצה אולאית משמש במינים שונים של בעלי חיים17. חזירים18, כבשים19 וכלבים20 שנמסרו לזריקת OA מציגים מאפיינים קליניים רבים של המחלה עם תפקוד לקוי של קרום הנאדיות-נימיות וחדירות מוגברת עם חדירת חלבונים ותאים.
לדוגמה, OA ב 1.25 מיקרומטר מוזרק תוך ורידי חסם תחבורה transepithelial המוביל בצקת alveolarבצקת 15. לחלופין, במודל במבחנה באמצעות תאי A549, OA בריכוז של 10 מיקרומטר לא שינה את תעלת הנתרן אפיתל (eNAC) או את הביטוי של Na/K-ATPase. עם זאת, נראה כי OA מתחבר לשני הערוצים, מעכב ישירות את פעילותם21 . הזרקת OA תוך ורידית במינון 0.1 מ”ל/ק”ג גרמה לגודש ונפיחות ברקמת הריאה, הפחיתה את רווחי הנאדיות עם מחיצת מכתשית מעובה והגדילה את ספירת תאי הדם הדלקתיים והאדומים22. כמו כן, OA גרם אפופטוזיס ונמק בתאי אנדותל ואפיתל בריאה15. הזרקת תמיסת טריס-אולאט, תוך טרכלית בעכברים, הגבירה את חדירת הנויטרופילים והבצקת כבר 6 שעות לאחר גירוי23. הזרקת OA לאחר 24 שעות העלתה את רמות הציטוקינים מעודדי דלקת (כלומר, TNF-α, IL-6 ו- IL-1β)23. בנוסף, הזרקה תוך ורידית (מקלעת מסלולית) של 10 מיקרומטר של טריס-אולאט מעכבת פעילות ריאתית Na/K-ATPase, בדומה לאואבין ב-10-3 מיקרומטר, מעכב אנזים סלקטיבי. כמו כן, OA גורם לדלקת עם חדירת תאים, היווצרות גופי שומנים וייצור לויקוטרין B4 (LTB4) ופרוסטגלנדין E2 (PGE2)22,24. לכן, ARDS המושרה על ידי חומצה אולאית יוצר בצקת, דימום, חדירת נויטרופילים, פעילות מוגברת של מיאלופוקסידז (MPO) ו- ROS24. לפיכך, ניהול OA הוא מודל מבוסס היטב לפגיעה ריאתית22,25. כל התוצאות המוצגות במאמר זה כי יש OA מייצג את צורת מלח, נתרן oleate.
Protocol
Representative Results
Discussion
בחירת מודל ARDS הנכון חיונית לביצוע המחקרים הפרה-קליניים, ועל המעריך לשקול את כל המשתנים האפשריים, כגון גיל, מין, שיטות ניהול ואחרים6. המודל שנבחר חייב לשחזר את המחלה בהתבסס על גורמי סיכון כגון אלח דם, תסחיף שומנים, איסכמיה-רפרפוזיה של כלי הדם הריאתיים וסיכונים קליניים אחרים<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המכון אוסוולדו קרוז, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), וה-Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). איור 1 ואיור 2 נוצרים באמצעות BioRender.com.
Materials
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D’Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 18 (2019).
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies – Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -. y. a. l., et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
