Modèle murin du syndrome de détresse respiratoire aiguë induit par l’acide oléique

Summary

Le présent protocole décrit un modèle de lésion pulmonaire chez la souris utilisant de l’acide oléique pour imiter le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Ce modèle augmente les médiateurs inflammatoires de l’œdème et diminue la compliance pulmonaire. L’acide oléique est utilisé sous forme de sel (oléate) car cette forme physiologique évite le risque d’embolie.

Abstract

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une menace importante pour les patients gravement malades avec un taux de mortalité élevé. L’exposition aux polluants, à la fumée de cigarette, aux agents infectieux et aux acides gras peut induire le SDRA. Les modèles animaux peuvent imiter le mécanisme pathologique complexe du SDRA. Cependant, chacun d’entre eux a des limites. Notamment, l’acide oléique (OA) est augmenté chez les patients gravement malades avec des effets nocifs sur les poumons. L’arthrose peut induire des lésions pulmonaires par embolie, perturbant les tissus, modifiant le pH et altérant la clairance de l’œdème. Le modèle de lésion pulmonaire induite par l’arthrose ressemble à diverses caractéristiques du SDRA avec des lésions endothéliales, une perméabilité alvéolaire accrue, une inflammation, la formation d’hyalines membranaires et la mort cellulaire. Dans ce document, l’induction d’une lésion pulmonaire est décrite par injection d’arthrose (sous forme de sel) directement dans le poumon et par voie intraveineuse chez une souris, car il s’agit de la forme physiologique de l’arthrose à pH 7. Ainsi, l’injection d’arthrose sous forme de sel est un modèle animal utile pour étudier les lésions pulmonaires/SDRA sans provoquer d’emboles ni modifier le pH, se rapprochant ainsi de ce qui se passe chez les patients gravement malades.

Introduction

Ashbaugh et ^al.1, en 1967, ont décrit pour la première fois le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et depuis lors, ils ont fait l’objet de multiples révisions. Selon la définition de Berlin, le SDRA est une inflammation pulmonaire qui entraîne une insuffisance respiratoire aiguë et une hypoxémie (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) en raison d’un déséquilibre du rapport ventilation/perfusion, d’une lésion alvéolaire bilatérale diffuse (DAD) et d’un infiltrat, d’une augmentation du poids pulmonaire et d’un œdème ^2,3. Le parenchyme pulmonaire est un environnement cellulaire complexe composé de cellules épithéliales, endothéliales et autres. Ces cellules forment des barrières et des structures responsables des échanges gazeux et de l’homéostasie dans les alvéoles³. Les cellules les plus abondantes au sein de la barrière épithéliale sont les cellules alvéolaires de type I (AT1) avec une plus grande surface pour l’échange gazeux et la gestion des fluides par Na/K-ATPase. De plus, les cellules alvéolaires de type II (AT2) produisent un tensioactif, ce qui réduit la tension superficielle dans les alvéoles⁴. En dessous, les cellules endothéliales forment une barrière semi-perméable séparant la circulation pulmonaire de l’interstitium. Ses fonctions comprennent la détection des stimuli, la coordination des réponses inflammatoires et la transmigration cellulaire⁵. Les cellules endothéliales régulent également les échanges gazeux, le tonus vasculaire et la coagulation⁵. Par conséquent, les troubles de la fonction endothéliale et épithéliale peuvent exacerber un phénotype pro-inflammatoire, causant des lésions pulmonaires conduisant au SDRA⁵.

Le développement du SDRA est associé à un risque de pneumonie bactérienne et virale ou à des facteurs indirects tels que la septicémie non pulmonaire, les traumatismes, les transfusions sanguines et la pancréatite⁶. Ces conditions provoquent la libération de motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP), induisant des cytokines et des chimiokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l’IL-1β, l’IL-6 et l’IL-8⁵. Le TNF-α est lié à la dégradation de la cadhérine endothéliale vasculaire (VE-cadhérine) dans la perturbation de la barrière endothéliale et l’infiltration des leucocytes dans le parenchyme pulmonaire. Les neutrophiles sont les premières cellules à migrer, attirées par l’IL-8 et LTB₄ ^5,7,8. Les neutrophiles augmentent encore les cytokines pro-inflammatoires, les espèces réactives de l’oxygène (ROS)⁹ et la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), générant des dommages endothéliaux et épithéliaux supplémentaires¹⁰. Les lésions épithéliales provoquent l’inflammation et l’activation des récepteurs de type Toll dans les cellules AT2 et les macrophages résidents, induisant la libération de chimiokines attirant les cellules inflammatoires vers les poumons⁴. De plus, la production de cytokines comme l’interféron-β (INF_β) provoque des récepteurs inducteurs d’apoptose liés au TNF (TRAIL), conduisant les cellules ATII à l’apoptose, altérant le liquide et la clarté ionique⁴. La perturbation de la structure de la barrière endothéliale et épithéliale permet l’afflux de liquide, de protéines, de globules rouges et de leucocytes dans l’espace alvéolaire, provoquant un œdème. Une fois l’œdème établi, l’effort pulmonaire pour maintenir la respiration et les échanges gazeux sont altérés¹¹. L’hypercapnie et l’hypoxémie induisent la mort cellulaire et la perturbation du transport du sodium, aggravant l’œdème alvéolaire dû à une faible capacité de clairance¹⁰. Le SDRA présente également des taux élevés d’IL-17A, associés à un dysfonctionnement des organes, à une augmentation du pourcentage de neutrophiles alvéolaires et à une perméabilité alvéolaire⁹.

Il y a eu des progrès continus dans la recherche sur la physiopathologie, l’épidémiologie et le traitement du SDRA au cours des dernières années^12,13. Cependant, le SDRA est un syndrome hétérogène malgré les progrès de la recherche thérapeutique aboutissant à l’optimisation de la ventilation mécanique et de la fluidothérapie. Ainsi, un traitement pharmacologique direct plus efficace est encore nécessaire¹⁰, et les études animales peuvent aider à dévoiler les mécanismes du SDRA et les cibles d’intervention.

Les modèles actuels de SDRA ne sont pas en mesure de reproduire complètement la pathologie. Ainsi, les chercheurs choisissent souvent le modèle qui pourrait le mieux correspondre à leurs intérêts. Par exemple, le modèle d’induction des lipopolysaccharides (LPS) induit le SDRA par choc endotoxique déclenché principalement par TLR4¹⁴. L’induction de HCl imite l’aspiration de l’acide, et les dommages sont neutrophies¹⁴. D’autre part, le modèle actuel d’oléate de sodium induit des lésions endothéliales qui augmentent la perméabilité vasculaire et l’œdème. De plus, l’utilisation d’oléate de sodium au lieu de l’acide oléique sous forme liquide permet d’éviter les risques d’embolie et d’altération du pH sanguin¹⁵.

Modèles d’animaux pour le SDRA
Les études précliniques sur des modèles animaux aident à comprendre la pathologie et sont essentielles pour la recherche sur les nouveaux traitements du SDRA. Le modèle animal idéal doit présenter des caractéristiques ressemblant à la situation clinique et une bonne reproductibilité des mécanismes de la maladie avec des caractéristiques physiopathologiques pertinentes pour chaque stade, évolution et réparation de la maladie¹⁴. Plusieurs modèles animaux sont utilisés pour évaluer les lésions pulmonaires aiguës dans le SDRA de manière préclinique. Cependant, comme tous les modèles ont des limites, ils ne reproduisent pas entièrement la pathologie humaine 6,14,16. Le SDRA induit par l’acide oléique est utilisé chez différentes espèces animales¹⁷. Les porcs¹⁸, les moutons¹⁹ et les chiens²⁰ soumis à l’injection d’arthrose présentent de nombreuses caractéristiques cliniques de la maladie avec un dysfonctionnement de la membrane alvéolaire-capillaire et une perméabilité accrue avec l’infiltration des protéines et des cellules.

Par exemple, l’arthrose à 1,25 μM injectée par voie intraveineuse a bloqué le transport transépithélial, ce qui a conduit à un œdème alvéolaire¹⁵. Alternativement, dans le modèle in vitro utilisant des cellules A549, l’arthrose à une concentration de 10 μM n’a pas modifié le canal sodique épithélial (eNAC) ou l’expression de la Na/K-ATPase. Cependant, l’arthrose semble s’associer aux deux canaux, inhibant directement leur activité²¹. L’injection intraveineuse d’arthrose à raison de 0,1 mL/kg a provoqué une congestion et un gonflement des tissus pulmonaires, une réduction des espaces alvéolaires avec un épaississement des cloisons alvéolaires et une augmentation du nombre de globules inflammatoires et de globules rouges²². De plus, l’arthrose induit l’apoptose et la nécrose dans les cellules endothéliales et épithéliales du poumon¹⁵. L’injection d’une solution de tris-oléate, par voie intratrachéale chez la souris, a favorisé l’infiltration des neutrophiles et l’œdème dès 6 h après la stimulation²³. L’injection d’arthrose à 24 h a augmenté les taux de cytokines pro-inflammatoires (c’est-à-dire le TNF-α, l’IL-6 et l’IL-1β)²³. De plus, l’injection intraveineuse (plexus orbitaire) de 10 μM d’un tris-oléate inhibe l’activité pulmonaire de la Na/K-ATPase, similaire à celle de l’ouabaïne à ^10-3 μM, un inhibiteur enzymatique sélectif. De plus, l’arthrose induit une inflammation avec infiltration cellulaire, formation de corps lipidiques et production de leucotriène B4 (LTB₄) et de prostaglandine E2 (PGE₂)^22,24. Par conséquent, le SDRA induit par l’acide oléique génère un œdème, une hémorragie, une infiltration de neutrophiles, une augmentation de l’activité myéloperoxydase (MPO) et des ROS²⁴. Par conséquent, l’administration d’arthrose est un modèle bien établi pour les lésions pulmonaires^22,25. Tous les résultats présentés dans cet article qui contiennent de l’arthrose représentent la forme saline, l’oléate de sodium.

Protocol

Les procédures utilisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux de la Fondation Oswaldo Cruz (licences CEUA n°002-08, 36/10 et 054/2015). Des souris Webster suisses mâles pesant entre 20 et 30 g, fournies par l’Institut des sciences et de la technologie des biomodèles (ICTB) de la Fondation Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), ont été utilisées pour les expériences. Les animaux étaient gardés dans des isolateurs ventilés dans le vivarium du Pavilhão Ozório d…

Representative Results

Dans un poumon non blessé, la clairance du liquide alvéolaire se produit par le transport d’ions à travers la couche épithéliale alvéolaire intacte. Le gradient osmotique transporte le liquide des alvéoles vers l’interstitium pulmonaire, où il est drainé par les vaisseaux lymphatiques ou réabsorbé. La Na/K-ATPase pilote ce transport11. L’arthrose est un inhibiteur de la Na/K-ATPase27 et du canal sodique 21, ce qui peut contribuer à la formation d’œdème…

Discussion

La sélection du bon modèle de SDRA est essentielle pour mener à bien les études précliniques, et l’évaluateur doit tenir compte de toutes les variables possibles, telles que l’âge, le sexe, les méthodes d’administration et autres⁶. Le modèle choisi doit reproduire la maladie en fonction des facteurs de risque tels que la septicémie, l’embolie lipidique, l’ischémie-reperfusion du système vasculaire pulmonaire et d’autres risques cliniques¹⁴. Cependant…

Materials

Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A