共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉
Summary
侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。
Abstract
癌細胞の浸潤および転移性拡散は、癌による死の主な原因である。癌細胞集団の浸潤性ポテンシャルを測定するために早期に開発されたアッセイは、典型的には、異なる浸潤ポテンシャルを有するがん細胞サブポピュレーションを区別しない単一のエンドポイント測定を生成する。また、腫瘍微小環境は、癌細胞の浸潤挙動を変化させ、関与する異なる常在間質および免疫細胞からなる。組織への侵入はまた、組織リモデリングおよび血管新生の間に微生物をかわすか、または実質および内皮細胞から罹患細胞を排除する免疫細胞亜集団において役割を果たす。インピーダンスバイオセンサーを利用して細胞浸潤を監視するリアルタイム細胞解析(RTCA)は、エンドポイントの浸潤測定を超えた大きな前進でした:これは、時間の経過とともに継続的な測定を提供し、エンドポイントアッセイで失われる浸潤率の違いを明らかにすることができます。現在のRTCA技術を使用して、間質および/または免疫細胞を含むことができ、共培養間質または免疫細胞からの分泌因子の影響下での浸潤速度を経時的に測定できるさらなるチャンバーを追加することによって、デュアルチャンバーアレイを拡張した。これを超えて、このユニークな設計により、いつでもチャンバーを剥離し、最も浸潤性の高いがん細胞、または試験した腫瘍分離株の不均一な混合物中に存在する他の細胞亜集団を単離することができます。これらの最も浸潤性の高いがん細胞および他の細胞亜集団は、転移性疾患への悪性進行を駆動し、それらの分子特性は、詳細な機構的研究、それらの検出のための診断プローブの開発、および脆弱性の評価にとって重要である。したがって、小分子または大分子の薬物の包含は、(例えば、癌細胞)浸潤行動を阻害または増強する(例えば、免疫細胞)ことを目的として、癌および/または間質細胞亜集団を標的とする治療法の可能性を試験するために使用することができる。
Introduction
細胞浸潤は、間質細胞によって提供される環境的手がかりに応答して、細胞が基底膜障壁を通過することを可能にする重要なプロセスである。これは、免疫応答、創傷治癒、組織修復、および局所病変から浸潤性および転移性癌に進行する可能性のある悪性腫瘍の発達のいくつかの段階における重要なステップである1。細胞集団の侵襲的可能性を測定するために早期に開発されたアッセイは、典型的には、単一のエンドポイント測定を生成するか、または侵襲的細胞の事前標識を必要とする2。マイクロエレクトロニクスとマイクロフルイディクス技術の統合は、微小電極3,4上の生細胞の電気インピーダンスを使用して、生存率、動き、および付着などの細胞生物学のさまざまな側面を検出するために開発されています。インピーダンス測定により、ラベルフリー、非侵襲的、定量的な細胞状態の評価が可能になります3。ここでは、Abassiらによって開発されたリアルタイム細胞解析(RTCA)システムの設計に基づく3チャンバーアレイについて説明します。3チャンバーアレイは、細胞侵入に関する共培養細胞の評価および追加の分析または拡張のための侵襲性細胞の回収を可能にする。
細胞分析システムでは、細胞は多孔性膜上にコーティングされた細胞外マトリックスを介して侵入し、障壁の反対側に位置するデジタル化された電極アレイに到達する。侵襲的なセルが時間の経過とともにこの電極アレイを取り付けて占有し続けると、電気インピーダンスは並列に変化します。現在のシステムは、2つのチャンバーを有する細胞浸潤および遊走(CIM)16ウェルプレートを含む。RTCA-DP(デュアルパーパス)(以下、デュアルパーパスセルアナライザと呼ぶ)機器には、インピーダンス測定用のセンサと、インピーダンスデータを分析および処理するための統合ソフトウェアが含まれています。ベースラインでのインピーダンス値は、ウェル内の培地のイオン強度に依存し、細胞が電極に付着するにつれて変化します。インピーダンスの変化は、細胞の数、その形態、および細胞が電極に付着する程度に依存する。細胞が添加される前の培地を含むウェルの測定は、バックグラウンドシグナルとみなされます。バックグラウンドは、セルが電極に付着および拡散して平衡に達した後のインピーダンス測定から差し引かれます。セルインデックス(CI)と呼ばれる電極上のセルの状態の単位のないパラメータは、CI =(平衡後のインピーダンス – セルの非存在下でのインピーダンス)/公称インピーダンス値6のように計算されます。異なる細胞株の遊走速度を比較する場合、デルタCIを使用して、最初の数回の測定で表された付着の違いに関係なく、細胞の状態を比較することができます。
新しく設計された3チャンバーアレイは、既存の設計に基づいて構築され、電極を含むデュアルパーパスセルアナライザシステムのトップチャンバを使用します。修正された中央チャンバとボトムチャンバは、統合されたソフトウェアを使用してインピーダンス測定と解析を行うために、アセンブリをデュアルパーパスセルアナライザに適合させるように適合されています。新しい設計が既存のデュアルチャンバーCIMプレート(以下、セルアナライザープレートと呼ぶ)に対して提供する2つの大きな進歩は、i)異種細胞ミックスに存在する侵襲性細胞亜集団を回収し、分析する能力と、ii)共培養間質または免疫細胞からの分泌因子が細胞浸潤に及ぼす影響を評価するオプションです(図1)。
この技術は、異なる侵襲能力を有する細胞の亜集団を研究するのに有用であり得る。すなわち、(a)周囲の組織または血液およびリンパ管に侵入する浸潤性癌細胞、または遠隔臓器の転移性播種部位で溢出する浸潤性癌細胞、(b)病原体または罹患細胞に対処するために組織に侵入する免疫系からの細胞、(c)組織再編成または創傷治癒中に組織に侵入して新しい血管を形成する内皮細胞、 (d)腫瘍微小環境からの間質細胞が癌細胞と共に支持および浸潤する。このアプローチは、細胞の運動性および浸潤を調節することができる間質クロストークの包含を可能にする。ここに示した実現可能性研究は、癌細胞からの差異シグナルに応答した内皮浸潤を含むモデル系として、癌細胞浸潤および間質との相互作用に焦点を当てたこの改変アレイを使用する。このアプローチは、癌細胞および免疫細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の亜集団などの他の細胞型を単離するために外挿され得る。我々は、原理の証明として浸潤性および非浸潤性の確立された乳癌細胞株を試験した。また、ヒト骨髄由来の免疫細胞に応答した患者由来の異種移植片(PDX)浸潤由来の細胞を用いて、臨床診断の現場においても将来の使用の可能性を示した。PDXは、元の患者に対する成長、進行、および治療選択肢の研究を可能にするために免疫不全またはヒト化マウスモデルに移植された患者腫瘍組織7、8である。
Protocol
Representative Results
Discussion
デュアルチャンバーアレイの設計を変更し、間質細胞の存在下で細胞侵入をリアルタイムで監視するための第3チャンバーを含めました。我々は、共培養線維芽細胞が浸潤性および非浸潤性癌細胞に対して有する明確な効果を観察し、このアレイを使用して、共培養間質細胞によって産生される因子に対して異なる応答を示す癌細胞亜集団を区別することができることを示している。このアレ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ユタ大学ハンツマンがん研究所のアラナ・ウェルムズ博士に、患者由来の異種移植片(HCI-010)を提供してくださったことに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01CA205632、R21CA226542、および部分的にはAgilent Technologiesからの助成金によって支援されました。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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