Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture
Summary
Descriviamo un approccio per rilevare e catturare sottopopolazioni cellulari invasive in tempo reale. Il progetto sperimentale utilizza l’analisi cellulare in tempo reale monitorando i cambiamenti nell’impedenza elettrica delle cellule. Il cancro invasivo, le cellule immunitarie, endoteliali o stromali nei tessuti complessi possono essere catturati e l’impatto delle co-colture può essere valutato.
Abstract
L’invasione e la diffusione metastatica delle cellule tumorali sono la principale causa di morte per cancro. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni di cellule tumorali in genere generano una singola misurazione dell’endpoint che non distingue tra sottopopolazioni di cellule tumorali con diverso potenziale invasivo. Inoltre, il microambiente tumorale è costituito da diverse cellule stromali e immunitarie residenti che alterano e partecipano al comportamento invasivo delle cellule tumorali. L’invasione nei tessuti svolge anche un ruolo nelle sottopopolazioni di cellule immunitarie respingendo i microrganismi o eliminando le cellule malate dal parenchima e dalle cellule endoteliali durante il rimodellamento dei tessuti e l’angiogenesi. L’analisi cellulare in tempo reale (RTCA) che utilizza biosensori di impedenza per monitorare l’invasione cellulare è stato un importante passo avanti oltre la misurazione dell’invasione degli endpoint: fornisce misurazioni continue nel tempo e quindi può rivelare differenze nei tassi di invasione che vengono persi nel test dell’endpoint. Utilizzando l’attuale tecnologia RTCA, abbiamo ampliato gli array a doppia camera aggiungendo un’ulteriore camera che può contenere cellule stromali e / o immunitarie e consente di misurare il tasso di invasione sotto l’influenza di fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate nel tempo. Oltre a questo, il design unico consente di staccare le camere in qualsiasi momento e isolare la cellula tumorale più invasiva o altre sottopopolazioni cellulari presenti in miscele eterogenee di isolati tumorali testati. Queste cellule tumorali più invasive e altre sottopopolazioni cellulari guidano la progressione maligna verso la malattia metastatica e le loro caratteristiche molecolari sono importanti per studi meccanicistici approfonditi, lo sviluppo di sonde diagnostiche per la loro individuazione e la valutazione delle vulnerabilità. Pertanto, l’inclusione di farmaci a piccole o grandi molecole può essere utilizzata per testare il potenziale delle terapie che colpiscono il cancro e / o le sottopopolazioni di cellule stromali con l’obiettivo di inibire (ad esempio, le cellule tumorali) o migliorare (ad esempio, le cellule immunitarie) il comportamento invasivo.
Introduction
L’invasione cellulare è un processo importante che consente alle cellule di attraversare le barriere della membrana basale in risposta ai segnali ambientali forniti dalle cellule stromali. È un passo cruciale durante diverse fasi di sviluppo per le risposte immunitarie, la guarigione delle ferite, la riparazione dei tessuti e le neoplasie maligne che possono progredire dalle lesioni locali ai tumori invasivi e metastatici1. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni cellulari in genere generano una singola misurazione del punto finale o richiedono la pre-etichettatura delle cellule invasive2. L’integrazione di tecniche di microelettronica e microfluidica è ora sviluppata per rilevare diversi aspetti della biologia cellulare come la vitalità, il movimento e l’attaccamento utilizzando l’impedenza elettrica delle cellule vive sui microelettrodi 3,4. La misurazione dell’impedenza consente una valutazione senza etichette, non invasiva e quantitativa dello stato cellulare3. Qui descriviamo un array a tre camere basato sul progetto del sistema Real-Time Cellular Analysis (RTCA) sviluppato da Abassi et al.5. L’array a tre camere consente la valutazione di cellule co-coltivate sull’invasione cellulare e il recupero di cellule invasive per ulteriori analisi o espansioni.
Nel sistema di analisi cellulare, le cellule invadono attraverso una matrice extracellulare rivestita su una membrana porosa e raggiungono un array di elettrodi interdigitati posizionati sul lato opposto della barriera. Mentre le cellule invasive continuano ad attaccare e occupare questo array di elettrodi nel tempo, l’impedenza elettrica cambia in parallelo. Il sistema attuale comprende una piastra di invasione e migrazione cellulare (CIM) a 16 pozzetti con due camere. Lo strumento RTCA-DP (dual purpose) (chiamato d’ora in poi analizzatore di celle a doppio scopo) contiene sensori per la misurazione dell’impedenza e software integrato per analizzare ed elaborare i dati di impedenza. I valori di impedenza al basale dipendono dalla forza ionica dei mezzi nei pozzetti e vengono modificati quando le celle si attaccano agli elettrodi. I cambiamenti di impedenza dipendono dal numero di cellule, dalla loro morfologia e dalla misura in cui le cellule si attaccano agli elettrodi. Una misurazione dei pozzetti con i media prima che le celle vengano aggiunte è considerata come il segnale di fondo. Lo sfondo viene sottratto dalle misurazioni dell’impedenza dopo aver raggiunto l’equilibrio con le celle che si attaccano e si diffondono sugli elettrodi. Un parametro unitless dello stato delle celle su un elettrodo chiamato Cell Index (CI) è calcolato come segue: CI = (impedenza dopo l’equilibrio – impedenza in assenza di celle) / valore di impedenza nominale6. Quando vengono confrontati i tassi di migrazione di diverse linee cellulari, l’IC Delta può essere utilizzato per confrontare lo stato della cella indipendentemente dalla differenza di attaccamento rappresentata nelle prime misurazioni.
L’array a tre camere di nuova concezione si basa sul progetto esistente e utilizza la camera superiore del sistema di analisi delle celle a doppio scopo che contiene gli elettrodi. Le camere centrali e inferiori modificate sono adattate per adattare l’assemblaggio all’analizzatore di celle a doppio scopo per la misurazione e l’analisi dell’impedenza utilizzando il software integrato. I due principali progressi che il nuovo progetto fornisce rispetto alla piastra CIM a doppia camera esistente (chiamata piastra di analisi cellulare d’ora in poi) sono: i) la capacità di recuperare e quindi analizzare sottopopolazioni cellulari invasive presenti in miscele cellulari eterogenee e ii) l’opzione per valutare l’impatto dei fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate sull’invasione cellulare (Figura 1).
Questa tecnologia può essere utile nello studio delle sottopopolazioni di cellule con diverse capacità invasive. Ciò include (a) cellule tumorali invasive che invadono i tessuti circostanti o vasi sanguigni e linfatici o stravasano in siti di semina metastatica in organi distanti, (b) cellule del sistema immunitario che invadono i tessuti per affrontare agenti patogeni o cellule malate, (c) cellule endoteliali che invadono i tessuti per formare nuovi vasi sanguigni durante la riorganizzazione dei tessuti o la guarigione delle ferite, così come (d) le cellule stromali del microambiente tumorale che supportano e invadono insieme alle cellule tumorali. L’approccio consente l’inclusione di cross-talk stromali in grado di modulare la motilità e l’invasione cellulare. Gli studi di fattibilità mostrati qui utilizzano questo array modificato focalizzato sull’invasione delle cellule tumorali e sull’interazione con lo stroma come sistema modello, compresa l’invasione endoteliale in risposta a segnali differenziali dalle cellule tumorali. L’approccio può essere estrapolato per isolare le cellule tumorali e altri tipi di cellule come sottopopolazioni di cellule immunitarie, fibroblasti o cellule endoteliali. Abbiamo testato linee cellulari di cancro al seno stabilite invasive e non invasive come prova di principio. Abbiamo anche usato cellule dall’invasione di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) in risposta alle cellule immunitarie del midollo osseo umano per mostrare la fattibilità per un uso futuro anche in contesti diagnostici clinici. I PDX sono tessuti tumorali del paziente che vengono impiantati in un modello di topi immunocompromessi o umanizzati per consentire lo studio della crescita, della progressione e delle opzioni di trattamento per il paziente originale 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo modificato il design di un array a doppia camera per includere una terza camera per il monitoraggio dell’invasione cellulare in tempo reale in presenza di cellule stromali. Abbiamo osservato effetti distinti dei fibroblasti co-coltivati su cellule tumorali invasive e non invasive, indicando che l’array può essere utilizzato per distinguere tra sottopopolazioni di cellule tumorali che rispondono in modo diverso ai fattori prodotti da cellule stromali co-coltivate. L’array è stato utilizzato anche per monitorare …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la dott.ssa Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, Università dello Utah, per averci fornito gli xenotrapianti derivati dal paziente (HCI-010). Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01CA205632, R21CA226542 e, in parte, da una sovvenzione di Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
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