Mantenimento di colture di laboratorio di Gryllus bimaculatus, un modello ortottero versatile per l'agricoltura degli insetti e la fisiologia degli invertebrati

Summary

Questo documento delinea i metodi di base per standardizzare fattori importanti come la densità, la disponibilità di mangime, la fonte di idratazione e i controlli ambientali per l’allevamento a lungo termine di colture di laboratorio del grillo commestibile, Gryllus bimaculatus.

Abstract

Gryllus bimaculatus (De Geer) è un grillo di grandi dimensioni distribuito in tutta l’Africa e l’Eurasia meridionale dove viene spesso raccolto in natura come cibo umano. Al di fuori del suo areale nativo, la coltivazione di G. bimaculatus è fattibile grazie alla sua plasticità alimentare, al rapido ciclo riproduttivo, alla mancanza di fabbisogno di diapausa, alla tolleranza per l’allevamento ad alta densità e alla robustezza contro gli agenti patogeni. Pertanto, G. bimaculatus può essere un modello versatile per studi di fisiologia, comportamento, embriologia o genetica degli insetti.

I parametri culturali, come la densità di allevamento, i reffugia all’interno della gabbia, il fotoperiodo, la temperatura, l’umidità relativa e la dieta, influenzano tutti la crescita, il comportamento e l’espressione genica del cricket e dovrebbero essere standardizzati. Nella fiorente letteratura sull’allevamento di insetti per il consumo umano, questi grilli sono spesso impiegati per valutare i candidati additivi per mangimi derivati da residui di colture, sottoprodotti della lavorazione degli alimenti e altri flussi di rifiuti a basso costo.

Per supportare gli esperimenti in corso che valutano le prestazioni di crescita di G. bimaculatus e la qualità nutrizionale in risposta a substrati di alimentazione variabili, è stato sviluppato un set completo di protocolli standard per l’allevamento, la manutenzione, la manipolazione, la misurazione e l’eutanasia in laboratorio ed è presentato qui. Un mangime per cricket standard del settore si è dimostrato nutrizionalmente adeguato e funzionalmente appropriato per il mantenimento a lungo termine degli stock di riproduzione del cricket, nonché per l’uso come mangime di controllo sperimentale. L’allevamento di questi grilli ad una densità di 0,005 grilli / cm³ in gabbie di polietilene da 29,3 L con schermo a una temperatura media di 27 ° C su un fotoperiodo 12 chiaro (L) / 12 scuro (D), con fibra di cocco inumidita che serve sia come fonte di idratazione che come mezzo di ovodeposizione ha sostenuto con successo grilli sani per un arco di 2 anni. Seguendo questi metodi, i grilli in un esperimento controllato hanno prodotto una massa media di 0,724 g 0,190 g al raccolto, con l’89% di sopravvivenza e il 68,2% di maturazione sessuale tra lo stoccaggio (22 giorni) e il raccolto (65 giorni).

Introduction

Come tipizzato dall’insetto iconico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, l’uso degli insetti come organismi modello di laboratorio offre vantaggi distinti per gli studi in genetica, tossicologia e fisiologia¹. Le piccole dimensioni degli insetti riducono lo spazio necessario per le colture e la quantità di mangimi e materiali di consumo necessari. Molti insetti si riproducono rapidamente rendendoli particolarmente adatti alla creazione di linee genetiche specializzate e studi che richiedono la valutazione di più generazioni successive.

Molti studi si concentrano su insetti olometaboli come Drosophila, che presentano metamorfosi e pupa complete. Tuttavia, sono disponibili altri modelli, tra cui Gryllus bimaculatus (De Geer), il cricket da campo a due punte. G. bimaculatus è un insetto paurometabolo che subisce tra 7 e 11 stelle ninfali prima di raggiungere la maturità sessuale². Questo cricket mostra una vasta gamma di comportamenti legati alla selezione sessuale, tra cui la stridulazione, le esposizioni territoriali e la guardia del compagno³. I grilli immaturi sono diversi dalle larve delle specie di insetti olometaboli in quanto, simili a molti giovani paurometaboli, sono in grado di rigenerare gli arti persi e danneggiati durante l’ecdisi⁴. Inoltre, il genoma completamente sequenziato di G. bimaculatus è stato pubblicato nel 2021⁵. Queste caratteristiche rendono questi grilli attraenti come obiettivo per la ricerca di base.

I grilli da campo a due macchie sono ampiamente allevati per cibo umano e mangimi per animali. La scala di queste operazioni è spesso molto più ampia che per la ricerca di laboratorio ^6,7. Nonostante la differenza di scala, le sfide affrontate dai ricercatori si sovrappongono notevolmente a quelle incontrate dagli agricoltori di cricket commerciali. Queste considerazioni convergono nel contesto della ricerca di laboratorio che mira a migliorare la produzione di insetti commestibili. Mentre l’industria degli insetti commestibili continua ad evolversi e crescere, l’ottimizzazione degli input di mangime e di una miriade di altri aspetti della produzione è un obiettivo primario⁸. Studi di laboratorio che dimostrano miglioramenti misurati nell’efficienza di allevamento, nella sopravvivenza o nel tempo di generazione in questi grilli hanno il potenziale per contribuire ad aumentare la redditività delle operazioni di allevamento di cricket a lungo termine.

I protocolli di allevamento standardizzati consentono un confronto più ravvicinato tra gli studi che studiano l’ottimizzazione dell’allevamento. Ad oggi sono stati pubblicati pochi protocolli approfonditi per l’allevamento di G. bimaculatus in laboratorio. Un protocollo ideale rifletterebbe le condizioni incontrate nelle operazioni di allevamento di cricket del mondo reale, pur mantenendo le condizioni strettamente controllate necessarie per misurare con precisione i cambiamenti nelle prestazioni di crescita derivanti da trattamenti sperimentali ed evidenziando le strategie di mitigazione del rischio. I metodi descritti in questo documento sono stati sviluppati sulla base di protocolli, tecniche e apparati pubblicati utilizzati per allevare una varietà di specie di cricket in una vasta gamma di scale di produzione di laboratorio e commerciale 2,9,10,11,12. Questi metodi sono anche informati da diverse fonti non peer reviewed, tra cui bollettini tecnici non pubblicati e comunicazioni personali con gli agricoltori di cricket commerciali in Nord America. Questo protocollo è stato sviluppato con l’intenzione di facilitare la creazione di colture di laboratorio di G. bimaculatus specificamente per l’uso in prove relative all’agricoltura degli insetti.

Protocol

1. Preparazione del substrato di ovodeposizione NOTA: La fibra di cocco è un substrato di ovodeposizione ideale per G. bimaculatus. Per i metodi dettagliati su come separare la fibra di cocco dal mattone di cocco compresso e una nota sulla sicurezza respiratoria, vedere la fase 1.1 relativa ai materiali supplementari . Lavarsi le mani con acqua e sapone. Tarare un contenitore pulito su una bilancia e pesare una massa di fibra di c…

Representative Results

I dati che dimostrano il successo dell’allevamento di cricket dalla schiusa ai 65 giorni di età sono stati raccolti durante una prova di alimentazione di settembre 2021. I grilli sono stati coltivati da uova seguendo i passaggi 1.1.1-2.6.1 di questi protocolli e sei gabbie replicate sono state rifornite con 24 grilli casuali di 22 giorni (terza stella) dopo il passaggio 2.7 sopra. I grilli venivano poi allevati in condizioni ambientali; tuttavia, a causa di un malfunzionamento dell’unità di trattamento dell’aria dell’i…

Discussion

La semplicità di questo approccio all’allevamento di cricket può avvantaggiare una serie di aree di ricerca e rappresenta un modello generico per un allevamento di cricket di successo, facilmente adattabile a una varietà di esigenze sperimentali. Rispetto a molti altri studi di G. bimaculatus, la dimensione dell’adulto del corpo individuale è più piccola e la maturazione è più lenta¹⁴, che attribuiamo alla temperatura di allevamento sub-ottimale impostaci dalle circostanze. I metod…

Materials

31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3430CLBL	Used to house breeding stock
3-tier/12-tray Grow Light Stand	Fischer Scientific	NC1938548
50-gal (189.27L) tote bin with lid	Sterilite	#14796603	Used as secondary containment when handling crickets
50 mL polypropylene graduated cylinder	Fischer Scientific	S95171
7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3410CLBL	Used to house exprimental stock
Accuris 500 g x 0.01 g Balance	Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific	W3300-500	Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+"
Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush	Ace Hardware	#1803261
Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle	Fischer Scientific	03-421-160
Bright aluminum window screen	Phifer	UNSPSC# 11162108	Mesh size 18 x 16"
Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids	Wal-Mart	N/A
Deionized water
Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade	Home Depot	#313114935
Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12"	Uline	S-5189
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875714
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875713A
Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels	Home Depot	#205675843
Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks	Infinity Bond	Infinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri Cricket Diet	Land O' Lakes International	SKU#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer	Wal-Mart	N/A
Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block	Home Depot	#300679904