В этой статье описывается рабочий процесс методов, используемых для тестирования новых потенциальных медиаторов метастазирования меланомы и их механизма (механизмов) действия.
Метастазирование является сложным процессом, требующим от клеток преодоления барьеров, которые только неполностью моделируются анализами in vitro . Систематический рабочий процесс был создан с использованием надежных, воспроизводимых моделей in vivo и стандартизированных методов для выявления новых игроков в метастазировании меланомы. Этот подход позволяет выводить данные на конкретных экспериментальных этапах, чтобы точно охарактеризовать роль гена в метастазировании. Модели устанавливаются путем введения генетически модифицированных клеток меланомы с помощью внутрисердечных, внутрикожных или подкожных инъекций мышам с последующим мониторингом с последовательной визуализацией in vivo . Как только предварительно установленные конечные точки достигнуты, первичные опухоли и / или органы, несущие метастазы, извлекаются и обрабатываются для различных анализов. Опухолевые клетки могут быть отсортированы и подвергнуты любой из нескольких платформ «омики», включая секвенирование одноклеточной РНК. Органы проходят визуализацию и иммуногистопатологический анализ для количественной оценки общего бремени метастазов и картирования их конкретного анатомического местоположения. Этот оптимизированный конвейер, включая стандартизированные протоколы для приживления, мониторинга, сбора, обработки и анализа тканей, может быть принят для полученных от пациента краткосрочных культур и установленных линий клеток человека и мышей различных типов рака.
Высокая смертность, связанная с метастатической меланомой, в сочетании с ростом заболеваемости меланомой во всем мире1 (по оценкам, увеличение на 7,86% к 2025 году) требует новых подходов к лечению. Достижения в обнаружении целей зависят от воспроизводимых моделей метастазирования, очень сложного процесса. На протяжении всех этапов метастатического каскада клетки меланомы должны преодолевать бесчисленные барьеры для достижения уклонения иммунной системы и колонизации отдаленных тканей2. Устойчивость и адаптивность клеток меланомы возникают из множества факторов, включая их высокую генетическую мутационную нагрузку3 и их происхождение нервного гребня, которые придают решающую фенотипическую пластичность 3,4,5. На каждом этапе транскрипционные программы позволяют метастазирующим клеткам меланомы переключаться из одного состояния в другое на основе сигналов перекрестных помех с микросредой, включающей иммунную систему6, внеклеточную среду 7,8 и клеточную архитектуру физических барьеров9, с которыми они вступают в контакт. Например, клетки меланомы избегают иммунного надзора, снижая экспрессию важных иммунопраймирующих опухолевых факторов6.
Исследования описывают «преметастатическую нишу», в которой клетки меланомы секретируют хемокины и цитокины, чтобы подготовить отдаленный «целевой» орган для метастазирования10. Эти результаты поднимают важные вопросы о тропизме органов клеток метастатической меланомы и анатомическом пути, который они проходят для доступа к отдаленным тканям. Известно, что после интравазации клетки меланомы метастазируют через лимфатические (лимфатическое распространение) и кровеносные сосуды (гематогенное распространение)2,11. В то время как у большинства пациентов присутствует локализованное заболевание, небольшое подмножество случаев представляет собой отдаленное метастатическое заболевание и отсутствие лимфатической диссеминации (отрицательное вовлечение лимфатических узлов)11, что предполагает существование альтернативных метастатических путей для меланомы.
Когда они колонизируют метастатический участок, клетки меланомы подвергаются эпигенетической и метаболической адаптации12,13. Для доступа и вторжения в новые компартменты клетки меланомы используют протеазы14 и цитоскелетные модификации 11,15, которые позволяют им перемещаться и расти в новом месте. Трудность нацеливания на клетки меланомы заключается в сложности и количестве таких адаптаций; таким образом, на местах следует приложить усилия для экспериментального воссоздания как можно большего числа шагов и адаптаций. Несмотря на многочисленные достижения в анализах in vitro, таких как органоиды и 3D-культуры16,17, эти модели лишь неполностью повторяют метастатический каскад in vivo.
Мышиные модели показали ценность, установив баланс между воспроизводимостью, технической осуществимостью и моделированием заболеваний человека. Внутрисосудистые, ортотопически и гетеротопически имплантированные клетки меланомы из полученных пациентом ксенотрансплантатов или краткосрочных культур в иммуноскомпрометированных или гуманизированных мышах представляют собой основу обнаружения мишеней при метастатической меланоме. Тем не менее, этим системам часто не хватает важнейшего биологического ограничения на метастазирование: иммунной системы. Модели метастазирования сингенной меланомы, которые обладают этим ограничением, относительно редки в этой области. Эти системы, разработанные у иммунокомпетентных мышей, включая B16-F1018, семейство клеточных линийYUMM 19, SM120, D4M321, RIM322 или совсем недавно, клеточные линии меланомы RMS23 и M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , облегчают исследование сложной роли иммунного ответа хозяина в прогрессировании меланомы.
Здесь представлен конвейер для идентификации цели метастазирования меланомы. С увеличением и увеличением наборов данных «омики», генерируемых из когорт пациентов с меланомой, мы постулируем, что исследования, имеющие наибольшую клиническую перспективу, связаны с интеграцией больших данных, что приводит к тщательному функциональному и механистическому опросу 25,26,27,28. Используя мышиные модели для изучения потенциальных целей в метастатическом процессе, можно учитывать in vivo-специфические события и тканевые взаимодействия, тем самым увеличивая вероятность клинической трансляции. Изложены многочисленные методы количественной оценки метастатической нагрузки, предоставляющие дополнительные данные о результатах любого данного эксперимента. Описан протокол выделения одной клетки из опухолей в различных органах, чтобы помочь объективной характеристике экспрессии генов в метастатических клетках, которые могут предшествовать одноклеточному или объемному секвенированию РНК.
Цель этого технического отчета состоит в том, чтобы предложить стандартизированный, сверху донизу рабочий процесс для исследования потенциальных участников метастазирования меланомы. Поскольку эксперименты in vivo могут быть дорогостоящими и трудоемкими, стратегии максимизации э…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Отдел передовых исследовательских технологий (DART) в NYU Langone Health и, в частности, Исследовательскую лабораторию экспериментальной патологии, Центр геномных технологий, Лабораторию цитометрии и сортировки клеток, Доклиническое ядро визуализации, которые частично поддерживаются грантом поддержки онкологического центра Перлмуттера NIH / NCI 5P30CA016087. Мы благодарим Междисциплинарную кооперативную группу меланомы Нью-Йоркского университета (PI: Dr. Iman Osman) за предоставление доступа к краткосрочным культурам меланомы, полученным от пациента (10-230BM и 12-273BM), которые были получены с помощью протоколов, одобренных IRB (исследование универсального согласия #s16-00122 и междисциплинарное исследование Melanoma Cooperative Group #10362). Мы благодарим д-ра Роберта Кербеля (Университет Торонто) за предоставление клеточных линий меланомы 113/6-4L и 131/4-5B1* и д-ра Минхарда Херлина (Институт Вистар) за предоставление краткосрочных культур меланомы WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 меланомы**. E.H. поддерживается NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, премией Американского онкологического общества-Меланомы Research Alliance Team Science Award и NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; ПИ: И.О.). Рисунок 1 был создан с помощью Biorender.com.
#15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
#3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |