عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من عينات الأنسجة غير المتجانسة المجمدة بدون فرز الخلايا
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى عزل mRNAs الريبوسومية المترجمة الخاصة بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP.
Abstract
يشكل عدم التجانس الخلوي تحديات لفهم وظيفة الأنسجة المعقدة على مستوى النسخ. يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية إلى تجنب المزالق المحتملة الناجمة عن عدم تجانس الأنسجة ويطلق العنان لتحليل النسخ القوي. يوضح البروتوكول الموصوف هنا كيفية استخدام طريقة تنقية تقارب الريبوسوم المترجم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من كمية صغيرة من الخلايا المعبرة عن EGFP في نسيج معقد دون فرز الخلايا. هذا البروتوكول مناسب لعزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP المتاح مؤخرا ويمكن استخدامه أيضا لعزل الحمض النووي الريبي عن أي خلايا تعبر عن EGFP.
Introduction
مكنت النهج عالية الإنتاجية ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) والمصفوفات الدقيقة ، من استجواب ملفات تعريف التعبير الجيني على مستوى الجينوم. بالنسبة للأنسجة المعقدة مثل القلب والدماغ والخصية ، ستوفر البيانات الخاصة بنوع الخلية مزيدا من التفاصيل التي تقارن استخدام الحمض النووي الريبي من الأنسجة بأكملها1،2،3. للتغلب على تأثير عدم التجانس الخلوي ، تم تطوير طريقة ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) منذ أوائل عام 20104. TRAP قادر على عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من أنواع خلايا معينة دون تفكك الأنسجة. تم استخدام هذه الطريقة لتحليل translatome (mRNAs التي يتم تجنيدها إلى الريبوسوم للترجمة) في كائنات مختلفة ، بما في ذلك استهداف مجموعة نادرة للغاية من الخلايا العضلية في أجنة ذبابة الفاكهة5 ، ودراسة الخلايا الجذرية المختلفة في نموذج النبات Arabidopsis thaliana6 ، وإجراء تحليل النسخ للخلايا البطانية في الثدييات7.
يتطلب TRAP تعديلا وراثيا لتمييز الريبوسوم لكائن نموذجي. طور إيفان روزن وزملاؤه مؤخرا نموذجا للفأر يسمى وضع العلامات النووية وترجمة الماوس8 لتنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) ، والذي كان متاحا من خلال مختبر جاكسون منذ عام 2017. من خلال العبور مع خط الماوس Cre ، يمكن للباحثين استخدام نموذج الماوس NuTRAP هذا لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم ونوى الخلايا من الخلايا المعبرة عن Cre دون فرز الخلايا. في الخلايا المعبرة عن Cre التي تحمل أيضا أليل NuTRAP ، يسمح الريبوسوم الموسوم EGFP / L10a بعزل ترجمة mRNAs باستخدام مقايسات القائمة المنسدلة للتقارب. في نفس الخلية ، يسمح الغشاء النووي الموسوم بببتيد التعرف على البيوتين (BLRP) ، والذي يكون أيضا إيجابيا ل mCherry ، بالعزل النووي باستخدام التنقية القائمة على التقارب أو التألق. قام فريق البحث نفسه أيضا بإنشاء خط فأر مشابه يتم فيه تسمية الغشاء النووي فقط ب mCherry بدون البيوتين8. يتيح هذان الخطان المعدلان وراثيا للفأر الوصول إلى توصيف الملامح الجينومية والنسخ المقترنة لأنواع معينة من الخلايا محل الاهتمام.
يلعب مسار إشارات القنفذ (Hh) دورا مهما في نمو الأنسجة9. يعمل GLI1 ، وهو عضو في عائلة GLI ، كمنشط نسخ ويتوسط إشارات Hh. يمكن العثور على خلايا Gli1 + في العديد من الأعضاء التي تفرز الهرمونات ، بما في ذلك الغدة الكظرية والخصية. لعزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من خلايا Gli1 + باستخدام نموذج الماوس NuTRAP ، تم تهجين الفئران Gli1-CreERT2 مع الفئران NuTRAP. كما تم تهجين فئران Shh-CreERT2 مع فئران NuTRAP بهدف عزل خلايا تعبير القنفذ الصوتي (Shh). يوضح البروتوكول التالي كيفية استخدام Gli1-CreERT2 ؛ فئران NuTRAP لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من خلايا Gli1 + في خصيتي الفئران البالغة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تخفف فائدة تحليل نسخ الأنسجة الكاملة ، خاصة عند دراسة الأنسجة غير المتجانسة المعقدة. تصبح كيفية الحصول على الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية حاجة ملحة لإطلاق العنان لتقنية RNA-seq القوية. عادة ما يعتمد عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية على جمع نوع معين من الخلايا باستخدام…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا بواسطة NIH R00HD082686. نشكر زمالة الأبحاث الصيفية لجمعية الغدد الصماء إلى H.S.Z. كما نشكر الدكتور يوان كانغ على تربية مستعمرة الفئران والحفاظ عليها.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
