이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.
뉴런 발달 동안, 축삭은 피질 환경을 탐색하여 최종 목적지에 도달하고 시냅스 연결을 설정합니다. 성장 원뿔 – 축삭 발달의 원위 끝에 위치한 감각 구조 -이 과정을 실행합니다. 성장 원뿔의 구조와 역학을 연구하는 것은 축삭 발달과 신경 회로를 형성 할 수있는 주변 중추 신경계 (CNS)와의 상호 작용을 이해하는 데 중요합니다. 이것은 근본적인 연구 및 전임상 적 맥락에서 부상을 입은 후 축삭을 신경 회로에 재통합하는 방법을 고안 할 때 필수적입니다. 지금까지 성장 원뿔 역학에 대한 일반적인 이해는 주로 2 차원 (2D)으로 배양 된 뉴런에 대한 연구에 기반을두고 있습니다. 의심 할 여지없이 성장 원뿔 구조 역학 및 자극에 대한 반응에 대한 현재의 지식에 근본적이지만, 2D 연구는 손상되지 않은 CNS 조직에서 신경 성장 원뿔에 의해 마주 치는 생리적 3 차원 (3D) 환경을 잘못 나타냅니다. 최근에는 콜라겐 젤이 이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해 사용되어 3D에서 신경 발달을 조사 할 수있었습니다. 그러나 합성 2D 및 3D 환경 모두 CNS 조직 내에서 신호 전달 신호가 부족하여 축삭 현상의 확장 및 경로 찾기를 지시합니다. 이 프로토콜은 유기형 뇌 조각을 사용하여 축삭과 성장 원뿔을 연구하는 방법을 제공하며, 축삭 발달은 생리 학적으로 관련된 물리적 및 화학적 단서를 만난다. utero 및 ex utero electroporation에서 미세 조정되어 초분해능 현미경과 함께 형광 리포터를 드물게 전달함으로써이 프로토콜은 축삭 및 성장 원뿔 역학의 시각화를위한 방법론 적 파이프 라인을 제시합니다. 또한, 장기 및 라이브 셀 이미징 데이터의 분석에 대한 상세한 툴킷 설명이 포함되어 있습니다.
뉴런은 신경계의 기본 계산 단위를 나타내는 고도로 양극화 된 세포입니다. 그들은 입력 및 출력 부위의 구획화에 의존하는 정보를 수신하고 방출합니다 : 수상 돌기와 축삭, 각각1. 개발 중에 축삭은 목적지에 도달하기 위해 믿을 수 없을 정도로 복잡한 환경을 탐색하면서 확장됩니다. 축삭 네비게이션은 발달 축삭의 끝에 위치한 감각 구조 인 성장 원뿔에 의해 안내됩니다. 성장 원뿔은 환경 신호를 감지하고 세포 골격 2,3의 역동적 인 공간 재구성으로 변환하는 역할을합니다. 생성 된 형태 – 기계적 반응은 성장 원뿔이 트리거링 큐에서 연장되거나 후퇴하도록 지시하여 특정 축삭 기동으로 이어집니다.
축삭 확장 및 성장 원뿔 역학에 대한 현재의 이해는 2 차원 (2D) 기질 2,4,5,6,7에 대한 축삭 성장을 평가하는 연구에서 비롯됩니다. 이러한 선구적인 연구는 성장 원뿔과 성장 기질 사이의 정교한 상호 작용을 확인하고 접착성 및 강성과 같은 기질 특성에 의존하는 현저한 차이를 밝혀 냈습니다 8,9. 이러한 통찰력에 의해 주도 된 세포 외 환경 단서는 축삭 성장을 지시하는 가설을 세웠으며, 성장 원뿔 세포 골격은이 성장을실행하는 2,10,11,12. 주목할 만하게, 뉴런은 비접착성 기질(예를 들어, 폴리리신, 폴리오르니틴)13에서 축삭돌기를 연장할 수 있다. 더욱이, 기질 강성은 세포 접착제 복합체(8)와 무관하게 축삭 성장 속도에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 2D 기질에서 성장 원뿔 역학을 연구하는 것만으로는 축삭 성장 원뿔과 생체에서 발견되는 것과 같은 생리 학적으로 관련된 3D (3D) 환경의 상호 작용으로 인해 발생하는 힘의 균형을 정확하게 모델링 할 수 없습니다.
2D 분석의 한계를 극복하기 위해, 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학은 3D 행렬 8,9에서 연구되었다. 이러한 매트릭스는 더 많은 생리적 맥락을 제시하지만 축삭 성장의 세포 내재적 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 그것은 다양한 조건 및 약리학 적 치료법에서 단일 세포 방식으로 성장 콘 검사를 가능하게합니다9. 이러한 3D 환경에서 축삭은 뚜렷한 세포골격 역학을 나타내며 2D 배양 뉴런9에서 관찰된 것보다 빠르게 성장했습니다. 이 우아한 연구는 성장 원뿔 세포 골격의 재구성과 결과적으로 그 행동에 대한 추가 차원의 영향을 입증했습니다.
3D 매트릭스가 2D 표면에 비해 네이티브 유사 뉴런 발달 및 축삭 성장을 지원하는 명백한 이점에도 불구하고 중추 신경계 (CNS) 조직에서 관찰 된 역학의 복잡성을 반영 할 수없는 단순화 된 합성 스캐폴드로 남아 있습니다. 여기서, 전자궁 및 자궁 전기천공 에 의한 리포터 플라스미드의 전달은 뇌 유기형 슬라이스 배양 및 계내 살아있는 초분해능 영상화와 결합하여 생리학적 맥락 내에서 성장 원뿔 역학을 분석하였다. 이 방법론은 생체 내 환경의 3 차원성과 물리 화학적 구성의 복잡성을 경험하면서 축삭 발달을 시각화 할 수있게합니다. 마지막으로, 일반적으로 라이센스가 부여되고 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학을 측정하기위한 사용자 친화적 인 절차가 설명됩니다.
성장 원뿔이 어떻게 주변 환경을 감지하고 반응하여 동시 축삭 확장과 지침을 조정하는지는 여전히 논쟁의 문제입니다 3,18. 2D 기질에 대한 선구적인 연구는 축삭 형성, 성장 및 탐색 2,10,11,12,19 동안 성장 원뿔 역학을 유도하는 힘을 생성하는 근본적인 분자 메커니즘을 엿볼 수있었습니다. 보다 최근에, 3D 행렬에 대한 연구는 3차원이 성장 원뿔의 거동과 결과적으로 축삭 성장 8,9에 얼마나 많은 영향을 미치는지 밝혀냈다. 그럼에도 불구하고, 생체 내에서 성장 콘 역학을 지시하는 복잡한 메커니즘은 철저히 조사되어야 한다.
IUE 또는 EUE 뇌로부터의 유기형 슬라이스 배양물의 제조는 널리 활용되고 잘 문서화되어 있다. 그것은 과학자들이 살아있는 뇌 조직20,21에서 뉴런의 발달과 행동에 대한 통찰력을 얻을 수있게 해주는 황금 표준이되었습니다. 실제로이 기술은 다양한 고해상도 이미징 기술과 함께 성공적으로 활용되어 특정 분자 과정 및 형태 학적 사건을 현장에서 시각화했습니다. 이러한 연구들은 축삭 형성 및 연장 19,22, 피질 뉴 런 이동19,22,23,24, 센트로솜 역학 25,26, 미세소관 역학(27), 뿐만 아니라 시냅스 전후 구획(28,29)의 기능적 역학을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이 프로토콜은 실험 신경 생물학의 격차를 해결하고, 현장에서 피질 뉴런을 개발하는 성장 원뿔 역학을 시각화하고, 생체 외 급성 뇌 슬라이스 배양 및 얻은 데이터를 분석하는 도구를 시각화합니다.
급성 뇌 슬라이스 배양은 (1) 일부 연습을 통해 생성하기 쉽기 때문에이 프로토콜을 확립하기 위해 활용되었습니다. (2) 고해상도 라이브 셀 이미징을 허용할만큼 충분히 투명하면서도 준 생리적 환경에 매립 된 성장 원뿔을 연구 할 수있는 접근 가능한 시스템을 제시한다. (3) 무수한 트랜스제닉 마우스 라인과의 사용을 위해 확장될 수 있고; (4) IUE 또는 EUE와 결합하여 형광 리포터 및 세포 골격 프로브와 함께 기능 체계의 손실 / 이득 하에서 생체 내에서 성장 원뿔 및 축삭 돌기의 성능을 평가하는 분자 도구를 제공 할 수있는 거의 무한한 잠재력을 제공합니다.
이 방법론은 EUE와 IUE의 맥락에서 설명되었습니다. 여전히 매우 신뢰할 수 있는 방법이지만, EUE는 전달 방법으로 IUE로 얻은 것에 비해 무질서한 RG 네트워크를 나타내는 뇌 절편의 발생률이 증가하였다(도 4C). RG 어레이의 교란은 뉴런 이동과 축삭 신장패턴 30,31에 강하게 영향을 미칩니다. 이들은 주어진 시간에 분석을 위해 축삭을 찾을 위치와 탐색하는 환경의 유형을 예측하는 주요 매개 변수입니다. RG 네트워크가 크게 파괴 된 뇌 조각은 일반적으로 피질 뉴런 층화가 손상됩니다. 이것은 차례로 혼란스러운 궤적을 가진 축삭을 생성합니다. 따라서 RG 네트워크의 구조적 무결성을 제어하는 것이 좋습니다. 흥미롭게도, 열악한 구조적 완전성은 배아 뇌의 나이 증가와 관련이 있습니다. 실제로, 젊은 E12.5-E13.5 배아에서 그러한 효과는 전형적으로 관찰되지 않았다19.
현재 프로토콜은 철저하고 간단합니다. 그럼에도 불구하고 최적의 결과를 얻기 위해 특별한주의와주의를 기울여야하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이들은 프로토콜에서 명백하게 언급되었으며, (1) 희소 표지를 얻기 위해 전기천공에 사용되는 DNA의 양을 튜닝하는 것을 포함한다; (2) 뇌의 추출 동안 손상을 피하기; (3) 뇌 케이싱 동안 아가로스의 온도를 조절하는 단계; (4) 주어진 나이의 두뇌에 대한 아가로스의 이상적인 비율을 해결하는 단계; (5) 형광단의 선택, 그 경험은 다음과 같습니다. 프로토콜 최적화 동안, 계내 이미징에서 살아있는 세포에서 여러 형광단의 성능을 시험하였다. 단량체성 GFP 변이체는 LifeAct- 및 Lyn-태깅된 플라스미드의 제조를 위해 EGFP 및 NeonGreen-태깅된 플라스미드를 이 프로토콜에 대해 선택하였다(도 5A,B). 또한, RFP 변이체 mScarlet을 테스트하고 이 설정에 매우 적합한 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). 다량체 tRFP (이량체) 및 ZsGreen (사량체) (도 5C 및 보충 비디오 1, 오른쪽)을 또한 시험하였다. 이러한 빠른 폴딩 초휘 형광단은 DNA 전달 후 신속한 형광 신호 생성이 필요한 경우에 권장됩니다.
슬라이스 배양을 사용하는 일반적인 관행은 다른 두뇌의 조각을 사용하여 제어 및 실험 조건을 테스트하는 것입니다. 이것은 원치 않는 변동성의 고유 한 원인을 나타냅니다. 여기서, 동종 뉴런과 리포터의 발현을 독립적으로 변형시켜 동정할 수 있는 발현 시스템이 사용되었다. 이 시연에서(도 5C), 형광단 중 어느 하나를 발현하는 뉴런 사이에는 차이가 없었다. 그러나, 일례로서, Cre 민감성 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스 라인과 결합된 이러한 플라스미드 믹스는 야생형으로 남아있는 tRFP(Dre-sensitive) 뉴런으로 표지될 것이다. 대조적으로, ZsGreen (또한 Cre-sensitive)은 재결합 된 뉴런을 라벨링합니다. 따라서 두 개의 서로 다른 유전자형의 성장 원뿔과 표현형도 동일한 뇌 조각에서 동시에 나란히 연구 될 수 있습니다.
분석을 위해 축삭과 성장 원뿔의 국소화는 중요한 고려 사항입니다. 피질 뉴런은 심실 영역 (VZ)에서 피질 플레이트 (CP)쪽으로 방사상으로 이동하면서 편광됩니다. 이 과정 동안, 뉴런은 선도적 인 과정 (미래의 덴드라이트)과 축삭이 될 후행 과정을 형성하고, 결국 중간 영역 (IZ)에서 선구적인 축삭에 합류하여 축삭 관 (32)을 확립합니다. 따라서, 축삭 성장 원뿔을 포획하기 위해, CP를 빠져나가는 축삭 및 축삭 다발과 이미 연관된 초기 생성 축삭을 포함하는 IZ의 축삭 섬유에 대한 이미징이 수행되었다; 또는 결국, IZ를 횡단하고 그 아래로 확장되는 섬유에서(그림 7).
이 프로토콜은 유기형 슬라이스 내에서 뉴런의 초해상도 이미징을 수행하는 것을 가능하게 합니다. 역사적으로 광산란은 두꺼운 표본을 이미징 할 때 직면 한 중요한 문제였습니다. 지난 이십 년 동안 광학 기술의 광범위한 발전으로 두꺼운 시편의 이미징이 가능해졌습니다. 여기에서는 성장 원뿔과 같은 작은 구조물을 더 잘 시각화하기 위해 긴 작동 거리 목표를 사용했습니다. 불가피하게,이 프로토콜은 역행 액틴 흐름 또는 미세 소관 역학과 같은보다 상세한 이벤트를 캡처하지 않습니다. 더 낮은 NA(Numerical Aperture)를 필요로 하는 긴 작동 거리 목표는 두꺼운 조각의 정보를 보존합니다. 그러나 더 짧은 작업 거리의 목표와 함께 사용하도록 이 프로토콜을 조정할 수도 있었습니다. 이를 위해서는 구조적 무결성을 유지하기 위해 조각을 유리 바닥 접시로 부드럽게 옮겨야했습니다. 그러나이 방법을 사용하면 가스 교환 손실로 인해 생존율 ~ 15 시간이 단축되었습니다 (데이터는 표시되지 않음). 2D 문화권과 달리 3D의 성장 원뿔은 더 큰 부피를 차지하며 z축에서 이동 아티팩트 보정이 필요합니다. 상세한 사건을 이미지화하는 능력을 높이려면 현대 공초점 기술을 활용해야합니다. 따라서, 고감도 공초점 현미경(33)에서 이용가능한 z-Galvo와 같은 고속 스캐닝 z-스택 모터를 사용하는 것이 좋다.
참고로, 이 프로토콜은 세 가지 주요 제한 사항을 제시합니다. 첫째, 생체내에서 임의의 주어진 플라스미드의 발현 수준/발현 세포의 수를 조절하는 것은 종종 도전적이다. 이것은 동일한 플라스미드 농도를 유지하는 경우에도 모든 슬라이스 사이의 가변성을 도입한다. 따라서, 사용된 발현 벡터에서 조절 요소의 선택은 주의해서 미리 결정되어야 한다. 둘째, 멤브레인 인서트를 사용하여 상세한 이벤트를 이미징하는 것은 현재 실현 가능하지 않습니다. 이 두 번째 제한은 이전 단락에서 제안 된 방법 론적 업데이트로 극복 될 수 있습니다. 마지막으로, 성장 원뿔은 매우 감광성이며 빠르게 광표백 될 수 있습니다. 따라서 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 5 분 동안 성장 원뿔을 자주 이미징하면 종종 성장 원뿔이 붕괴 될 수 있습니다. 이와 관련하여, 광시트 현미경 생성 장치의 새로운 발전은 뇌 슬라이스(34)의 장기 이미징을 위해 적응될 수 있다.
이와 같은 프로토콜은 새로운 연구 길을 열어 성장 원뿔이 복잡한 생체 내 환경을 향해 읽고 반응하는 데 필요한 것을 더 잘 이해할 수있게하고, 더 중요한 것은이 정교한 상호 작용의 메커니즘을 풀기 위해 구상됩니다.
The authors have nothing to disclose.
절차를 촬영해 주신 Maria Eugenia Bernis에게 감사드립니다. 또한 원고를 읽고 토론해 주신 Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski, Sina Stern에게도 감사드립니다. 우리는 뛰어난 기술 조수, 제시카 고니어, 블랑카 랜델, 안투안 팜에게 감사드립니다. 우리는 DZNE의 광학 현미경 시설 및 동물 시설의 귀중한 지원을 인정합니다. 이 연구는 Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) 및 Wings for Life (F.B)의 지원을 받았습니다. F.B.는 우수 클러스터 ImmunoSensation2, SFB 1089 및 1158의 회원이며 Roger De Spoelberch Prize를 수상했습니다.
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Betadine | B. Braun | 3864154 | |
Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
Isoflurane | Virbac | NA | |
Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
Parafilm | VWR | 52858-000 | |
Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
Sucrose | Roth | 4621.2 | |
Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |