该协议展示了一种直接而稳健 的方法来研究原位 轴突生长和生长锥动态。它描述了如何制备 离体 生理相关的急性脑切片,并提供了用户友好的分析管道。
在神经元发育过程中,轴突在皮质环境中导航以到达其最终目的地并建立突触连接。生长锥 – 位于发育轴突远端尖端的感觉结构 – 执行此过程。研究生长锥的结构和动力学对于理解轴突发育以及与周围中枢神经系统(CNS)的相互作用至关重要,这些相互作用使其能够形成神经回路。在基础研究和临床前环境中设计将轴突重新整合到损伤后神经回路的方法时,这是必不可少的。到目前为止,对生长锥动力学的一般理解主要基于对二维(2D)培养的神经元的研究。虽然2D研究无疑是当前生长锥结构动力学和对刺激响应的知识的基础,但2D研究歪曲了完整中枢神经系统组织中神经元生长锥所遇到的生理三维(3D)环境。最近,胶原蛋白凝胶被用来克服其中一些限制,从而能够在3D中研究神经元发育。然而,合成的2D和3D环境都缺乏CNS组织内的信号线索,这些信号线索指导着发育中轴突的延伸和寻路。该协议提供了一种使用有机指型脑切片研究轴突和生长锥的方法,其中发育中的轴突遇到生理相关的物理和化学线索。通过将 子宫内 微调和 宫外 电穿孔相结合,稀疏地递送荧光报告基因以及超分辨率显微镜,该协议为轴突和生长锥动力学 的原位可视化提供了方法学管道。此外,还包括对长期和活细胞成像数据分析的详细工具包描述。
神经元是高度极化的细胞,代表神经系统中的基本计算单位。它们接收和发出依赖于输入和输出站点划分的信息:树突和轴突,分别为1。在开发过程中,轴突在导航令人难以置信的复杂环境以到达目的地时会延伸。轴突导航由生长锥引导,生长锥是位于发育轴突尖端的感觉结构。生长锥负责检测环境线索并将其转化为其细胞骨架2,3的动态空间重组。由此产生的形态力学反应指示生长锥从触发线索延伸或缩回,从而导致特定的轴突机动。
目前对轴突延伸和生长锥动力学的理解源于评估轴突在二维(2D)底物上生长的研究2,4,5,6,7。这些开创性研究确定了生长锥和生长基质之间复杂的相互作用,并揭示了取决于基材特性(如粘附性和刚度8,9)的显着差异。在这些见解的引导下,细胞外环境线索被假设为决定轴突生长,生长锥细胞骨架执行这种生长2,10,11,12。值得注意的是,神经元可以延长非粘性基质(例如,聚赖氨酸,聚鸟氨酸)中的轴突13。此外,基材刚度可以独立于细胞粘合剂复合物8影响轴突生长速率。因此,单独研究2D基质中的生长锥动力学不能准确地模拟轴突生长锥与生理相关三维(3D)环境(例如体内发现的那些)相互作用所产生的力的平衡。
为了克服2D测定的局限性,在3D基质8,9中研究了轴突生长和生长锥动力学。这些基质提出了更多的生理背景,但允许研究轴突生长的细胞内在机制。它能够在各种条件和药物治疗中以单细胞方式进行生长锥检查9。在这样的3D环境中,轴突表现出明显的细胞骨架动力学,并且比在2D培养神经元中观察到的轴突生长得更快9。这些优雅的研究表明,额外维度对生长锥细胞骨架的重组以及因此对其行为的影响。
尽管3D矩阵在支持天然神经元发育和轴突生长方面比2D表面具有明显的优势,但它们仍然是一个简化的合成支架,无法反映在中枢神经系统(CNS)组织中观察到的动力学的复杂性。在这里,通过宫外和子宫电穿孔递送报告质粒与脑器官切片培养和原位实时超分辨率成像相结合,以分析生理背景下的生长锥动力学。该方法允许在体验体内环境的三维性及其物理化学组成的复杂性的同时可视化发育轴突。最后,描述了使用常用许可和公开可用的软件测量轴突生长和生长锥动力学的用户友好型程序。
生长锥如何感知和响应周围环境以协调轴突同时延伸和引导仍然是一个有争议的问题3,18。2D底物的开创性研究提供了对在轴突形成,生长和导航期间产生驱动生长锥动力学的力的基本分子机制的一瞥2,10,11,12,19。最近,对3D矩阵的研究表明,第三维对生长锥的行为有多大影响,从而对轴突增长8,9有多大影响。然而,指导 体内 生长锥动力学的复杂机制仍有待彻底研究。
来自IUE或EUE大脑的有机细胞切片培养物的制备被广泛使用并有充分的记录。它已成为一个黄金标准,使科学家能够深入了解活脑组织中神经元的发育和行为20,21。事实上,该技术已成功与各种高分辨率成像技术结合使用,以 原位可视化特定的分子过程和形态学事件。这样的研究包括但不限于轴突形成和延伸19,22,皮质神经元迁移19,22,23,24,中心体动力学25,26,微管动力学27,以及突触前和突触后区室的功能动力学28,29。
该协议解决了实验神经生物学中的空白,可视化了 原位发育皮质神经元的生长锥动力学,在 离体 急性脑切片培养物中,以及分析所获得数据的工具。
使用急性脑切片培养物来建立该方案,因为它们(1)通过一些练习,易于产生;(2)提供一个可访问的系统来研究嵌入在准完全生理环境中的生长锥,但足够透明以允许高分辨率活细胞成像;(3)可与其使用无数转基因小鼠系扩展使用;(4)与IUE或EUE结合使用,提供几乎无限的潜力,以提供分子工具,以评估在功能状态的丧失/增益下体内生长锥和轴突的性能,以及荧光报告基因和细胞骨架探针。
在EUE和IUE的背景下描述了这种方法。虽然EUE仍然是一种高度可靠的方法,但与使用IUE作为递送方法获得的脑切片相比,显示无序RG网络的发生率增加(图4C)。RG阵列中的干扰强烈影响神经元迁移和轴突伸长率模式30,31。这些是关键参数,用于预测在给定时间在何处查找轴突以进行分析以及它们正在导航的环境类型。具有明显破坏RG网络的脑切片通常具有受损的皮质神经元分层。这反过来又会产生具有混沌轨迹的轴突。因此,强烈建议控制RG网络的结构完整性。有趣的是,结构完整性差与胚胎大脑年龄的增长有关。事实上,在年轻的E12.5-E13.5胚胎中通常没有观察到这种效应19。
目前的协议是彻底和直接的。然而,在一些关键步骤中,必须特别注意和注意以获得最佳结果。这些已经在方案中明确指出,包括(1)调整电穿孔中使用的DNA量以获得稀疏标记;(2)避免在拔脑过程中造成损伤;(3)在脑套管过程中控制琼脂糖的温度;(4)排除琼脂糖对特定年龄大脑的理想百分比;(5)荧光基团的选择,其经验如下。在方案优化期间,测试了活细胞 原位成像中 几种荧光基团的性能。该方案选择单体GFP变体EGFP和NeonGreen用于制备LifeAct和Lyn标记的质粒(图5A,B)。此外,RFP变体mScarlet经过测试,发现非常适合这种设置(未显示数据)。还测试了多聚体tRFP(二聚体)和ZsGreen(四聚体)(图5C 和 补充视频1, 右)。当该方法需要在DNA递送后快速生成荧光信号时,建议使用这些快速折叠的超亮荧光团。
使用切片培养物的常见做法是利用来自不同大脑的切片来测试控制和实验条件。这代表了不需要的可变性的固有来源。在这里,使用了一种表达系统,该系统可以独立修饰相邻神经元和报告基因的表达以进行识别。请注意,在该演示(图5C)中,表达任何一种荧光团的神经元之间没有差异。然而,作为一个例子,这样的质粒混合物与含有Cre敏感基因的转基因小鼠系相结合,将标记有tRFP(Dre敏感)神经元,这些神经元仍然是野生型的。相比之下,ZsGreen(也是Cre-sensitive)将标记重组神经元。因此,两种不同基因型的生长锥体,也可能是表型,可以在同一个大脑切片中同时并排研究。
用于分析的轴突和生长锥的定位是一个重要的考虑因素。皮质神经元极化,同时从心室区(VZ)向皮质板(CP)放射状迁移。在这个过程中,神经元形成一个引导过程(未来的树突)和一个尾随过程,该过程将成为轴突,最终在中间区(IZ)中加入开创性的轴突,建立轴突束32。因此,为了捕获轴突生长锥,在IZ中的轴突纤维上进行成像,包括离开CP的轴突和已经与轴突束相关的早期生成的轴突;或者最终,在穿过IZ并延伸到其下方的光纤中(图7)。
该协议使得对组织结构切片内的神经元进行超分辨率成像成为可能。从历史上看,光散射是成像厚标本时面临的一个重大问题。在过去的二十年中,光学技术的广泛进步使厚标本的成像成为可能。在这里,使用长工作距离物镜来更好地可视化较小的结构,例如生长锥。不可避免的是,该协议不会捕获更详细的事件,例如逆行肌动蛋白流或微管动力学。长工作距离物镜需要较低的数值孔径(NA),以保留来自厚切片的信息。但是,也可以调整该协议以用于更短工作距离的目标。这需要将切片平稳地转移到玻璃底培养皿中,以保持结构完整性。然而,由于气体交换的损失,使用这种方法导致存活期缩短-〜15小时(数据未显示)。与 2D 培养物不同,3D 中的生长锥占据更大的体积,并且需要在 z 轴上进行运动伪影补偿。为了提高对详细事件进行成像的能力,必须利用现代共聚焦技术。因此,建议使用快速扫描的z轴堆叠电机,例如高灵敏度共聚焦显微镜33上可用的z-Galvo。
值得注意的是,该协议存在三个主要限制。首先,在 体内控制任何给定质粒的表达水平/表达细胞数量通常具有挑战性。这引入了所有切片之间的可变性,即使在保持相同的质粒浓度时也是如此。因此,在所用表达载体中调节元件的选择必须谨慎地预先确定。其次,使用膜插入物对详细事件进行成像目前尚不可行。这第二个限制可以通过上一段所建议的方法更新来克服。最后,生长锥具有高度光敏性,可以迅速变成光漂白。因此,频繁成像生长锥细胞,使用激光扫描显微镜短短5分钟,通常可以使生长锥塌陷。在这点上,光片显微镜产生的装置的新进展可以适应于脑切片34的长期成像。
这种类似的协议被设想为开辟新的研究途径,从而更好地了解生长锥体阅读和应对复杂的 体内 环境所需的条件,更重要的是,解开这种复杂相互作用的机制。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢Maria Eugenia Bernis拍摄了这些程序。我们还要感谢Emily Burnside,Emily Handley,Thorben Pietralla,Max Schelski和Sina Stern阅读和讨论手稿。我们感谢我们杰出的技术助理Jessica Gonyer,Blanca Randel和Anh-Tuan Pham。我们感谢 DZNE 光学显微镜设施和动物设施的宝贵支持。这项工作得到了Deutsche Forschungsgesellschaft(DFG),国际截瘫研究基金会(IRP)和Wings for Life(至F.B)的支持。F.B.是卓越集群 ImmunoSensation2、SFBs 1089 和 1158 的成员,并且是 Roger De Spoelberch 奖的获得者。
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Betadine | B. Braun | 3864154 | |
Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
Isoflurane | Virbac | NA | |
Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
Parafilm | VWR | 52858-000 | |
Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
Sucrose | Roth | 4621.2 | |
Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |