Summary

Évaluation de la production de glucose hépatique dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques

Published: March 05, 2022
doi:

Summary

Cette étude décrit la mesure directe de la production hépatique de glucose dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques en utilisant un traceur de glucose isotopique stable via la veine caudale à jeun et riche en glucose en tandem.

Abstract

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est une maladie courante qui entraîne des troubles du métabolisme du glucose, tels que la résistance à l’insuline et l’intolérance au glucose. Le métabolisme du glucose dérégulé est une manifestation importante de la maladie et est la clé de sa pathogenèse. Par conséquent, les études impliquant une évaluation du métabolisme du glucose dans le SOPK sont de la plus haute importance. Très peu d’études ont quantifié la production hépatique de glucose directement dans les modèles SOPK à l’aide de traceurs de glucose non radioactifs. Dans cette étude, nous discutons des instructions étape par étape pour la quantification du taux de production hépatique de glucose dans un modèle murin SOPK en mesurant l’enrichissement M + 2 du [6,6-2H2]glucose, un traceur de glucose isotopique stable, par chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse (SMGC). Cette procédure implique la création d’une solution de traceur de glucose isotopique stable, l’utilisation de la mise en place d’un cathéter veineux de la queue et la perfusion du traceur de glucose à jeun et riche en glucose chez la même souris en tandem. L’enrichissement du [6,6-2H2]glucose est mesuré à l’aide du dérivé du pentaacétate dans le SMGC. Cette technique peut être appliquée à une grande variété d’études impliquant une mesure directe du taux de production hépatique de glucose.

Introduction

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est un trouble fréquent chez 12 % à 20 % des femmes en âge de procréer1,2. Il s’agit d’une maladie complexe entraînant des phénotypes variables impliquant des ovaires polykystiques, des règles irrégulières et des preuves cliniques ou de laboratoire d’hyperandrogénémie, et elle est généralement diagnostiquée lorsqu’une femme répond à deux des trois critères3. Un aspect prédominant du SOPK, et un facteur clé de sa pathogenèse, est les dérangements métaboliques que l’on trouve chez les femmes atteintes de la maladie. Les femmes atteintes du SOPK ont une incidence plus élevée de résistance à l’insuline, d’intolérance au glucose, d’obésité et de syndrome métabolique3,4,5,6. La résistance à l’insuline n’est pas seulement une manifestation de la maladie, mais on pense qu’elle contribue à sa pathogenèse en potentialisant l’action de l’hormone lutéinisante dans l’ovaire, entraînant ainsi une augmentation de la production d’androgènes7,8. On pense que la résistance à l’insuline a plusieurs origines possibles, mais des études suggèrent qu’elle pourrait être due à des schémas anormaux de signalisation des récepteurs de l’insuline9,10. Des études ont évalué la résistance à l’insuline chez les patients atteints du SOPK en utilisant la technique de référence de la pince hyperinsulinémique-euglycémique11,12,13,14,15. Les femmes atteintes du SOPK, indépendamment de l’IMC, ont des niveaux plus élevés de résistance à l’insuline que les témoins. Le contrôle de l’insuline sur la production de glucose est altéré dans les troubles de la résistance à l’insuline conduisant à une production excessive de glucose. Par exemple, les patients diabétiques ont des taux accrus de gluconéogenèse et une altération de la suppression de la glycogénolyse16. En outre, une altération de la suppression de la production de glucose a été observée chez des rats diabétiques17. Bien que les études sur les pinces puissent donner une mesure de la résistance à l’insuline, peu d’études sur le SOPK se concentrent sur la mesure directe de la production de glucose à jeun et en état d’alimentation. Cela nécessite l’utilisation d’une perfusion de traceur de glucose isotopique non radioactif et la mesure par spectrométrie de masse.

Les modèles animaux ont été largement utilisés dans la recherche sur le SOPK. Des modèles murins de SOPK maigre et de type obèse ont été créés en administrant des androgènes avant la naissance, prépubère ou post-puberté18. Les modèles de SOPK des rongeurs démontrent également des différences métaboliques par rapport à leurs témoins respectifs. Des données antérieures de notre laboratoire ont démontré des tests de tolérance au glucose anormaux (GTT) dans des modèles murins du SOPK (maigres et obèses), conformes à la littérature sur le SOPK humain19. L’utilisation d’un modèle animal maigre et obèse permet d’approfondir les recherches sur les différences métaboliques. Plus précisément, ce modèle permet d’évaluer le taux de production de glucose directement à l’aide de traceurs de glucose isotopiques. L’un des traceurs de glucose isotopiques stables les plus couramment utilisés est le glucose [6,6-2H2]. L’enrichissement en glucose [6,6-2H2] peut être mesuré à l’aide d’un dérivé de pentaacétate comme décrit précédemment20.

Dans cette étude, notre objectif était de mesurer le taux de production de glucose hépatique à jeun et à l’état riche en glucose chez les souris SOPK en utilisant une perfusion de glucose isotopique. Ces techniques peuvent être appliquées à un large éventail d’expériences impliquant la cinétique du glucose.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine. 1. Préparation du [6,6-2H2]glucose Un jour avant la procédure, préparez le traceur de glucose isotopique stable dans une solution saline normale. Pour cette expérience, le glucose [6,6-2H2] a été utilisé comme traceur pour mesurer le taux d’apparition du glucose pla…

Representative Results

À l’aide d’équations de dilution isotopique décrites précédemment, le taux de glucose plasmatique total (glucoseRa) a été calculé à partir de l’enrichissement M+2 du [6,6-2H2]glucose dans des conditions à jeun et riches en glucose à l’aide du dérivé de pentaacétate21. Dans des conditions d’équilibre, on suppose que le taux d’apparition du glucose est égal au taux de disparition du glucose. Dans le groupe témoin, le glucoseRa …

Discussion

L’hyperglycémie et le métabolisme anormal du glucose / homéostasie sont des caractéristiques du SOPK. Le taux de glucose dans le sang est maintenu par une combinaison de glucose provenant de l’alimentation et de la production de glucose via la glycogénolyse et la gluconéogenèse et la glycogenèse, sous le contrôle des hormones et des enzymes. La production hépatique de glucose est supprimée par la présence d’une augmentation des taux de glucose circulants. Dans les troubles du métabolisme anorm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de formation du Département d’obstétrique et de gynécologie, Baylor College of Medicine (ALG) et une subvention de recherche R-01 (Subvention # DK114689) pour CSB, SC et JM des National Institutes of Health.

Materials

0.9% sodium chloride solution McKesson 275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe VWR 75846-756 Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape 3M 70200400169
1-inch Labeling tape Fisher GS07F161BA Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush McKesson 191-MIH-2235 One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets Fisher Scientific NC9891620 5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone Sigma-Aldrich 650501
Advanced hot plate stirrer VWR 97042-602 Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles Health Warehouse A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles Medvet 305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
Beaker, 1000 mL Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap Fisher Scientific 05-719-120 For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet Amazon Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5% Sigma-Aldrich G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD VWR 62999-042
Magnifying glass Amazon Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance Ohaus Adventurer Pro AV264C Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL Sigma-Aldrich B0158-12EA Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump Harvard Apparatus 70-3024A
Plexiglass sheet Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers Any brand; used to cage mice during infusion

References

  1. March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
  2. Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
  3. . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
  4. Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
  5. Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
  6. Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
  7. Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
  8. Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
  9. Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
  10. Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
  11. Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
  12. Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
  13. Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
  14. Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
  15. Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
  16. Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
  17. Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).
  18. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  19. Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
  20. Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
  21. Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
  22. Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
  23. Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
  24. Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
  25. Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
  26. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
  27. Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
  28. Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
  29. Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).

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Gannon, A. L., Chacko, S. K., Didelija, I. C., Marini, J. C., Blesson, C. S. Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (181), e62991, doi:10.3791/62991 (2022).

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