Summary

הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

Published: November 05, 2021
doi:

Summary

הפלקה היא שיטה שגרתית המשמשת לכימות וירוסים חיים באוכלוסייה. למרות שהפלקה נלמדת לעתים קרובות בתוכניות לימודים מיקרוביולוגיות שונות עם חיידקים ובקטריופאג’ים, הפלקה של וירוסים יונקים מורכבת יותר וגוזלת זמן רב יותר. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים המתפקדים באופן אמין לעבודה רגילה עם וירוסי הרפס סימפלקס.

Abstract

ישנם פרוטוקולים רבים שפורסמו עבור וירוסים plaquing, כולל הפניות בתוך הספרות הראשית למתודולוגיה. עם זאת, וירוסים plaquing יכול להיות קשה לביצוע, הדורשים התמקדות מפרטים שלה עידון. זוהי שיטה מאתגרת להפליא עבור תלמידים חדשים לשלוט, בעיקר משום שהיא דורשת תשומת לב קפדנית לפרטים הקטנים ביותר. הדגמה זו של וירוסים הרפס סימפלקס plaquing צריך לעזור לאלה שנאבקו עם לדמיין את השיטה, במיוחד הניואנסים שלה, לאורך השנים. בעוד שכתב יד זה מבוסס על אותם עקרונות של מתודולוגיית הפלקה הסטנדרטית, הוא שונה בכך שהוא מכיל תיאור מפורט של (1) כיצד לטפל בצורה הטובה ביותר בתאים מארחים כדי למנוע הפרעה במהלך התהליך, (2) מדיום צמיג שימושי יותר מאשר אגרוז כדי להגביל את פיזור הוויריונים, ו – (3) הליך קיבעון והכתמה פשוט המייצר תוצאות ניתנות לשחזור אמינות. יתר על כן, הסרטון המצורף מסייע להדגים את ההבחנות העדינות בתהליך, אשר לעתים קרובות חסרים כאשר מנחים אחרים על ביצוע בדיקות פלאק.

Introduction

ראשיתם של בדיקות פלאק וירוס לחזור לתגליות הראשונות של וירוסים בשנות ה -18901. נגיף פסיפס הטבק היה מבודד לראשונה והועבר על עלי טבק, שם ניתן לזהות ולכמת כתמי זיהום בודדים שמקורם בישות וירוס חיה אחת2, שזוהתה מאוחר יותר כ- virion2. מחקרים ראשוניים מאוחרים יותר עם חיידקים ובקטריופאג’ים שיכללו את הטכניקות המשמשות לפלייק של וירוסים אלה, כולל חיידקים בשלב אמצע היומן של הצמיחה, דילול סדרתי של דגימות בקטריופאג ‘, ואגר העליון עם הדמיה מאוחרת יותר של חורים מילוליים (הנקראים פלאקים) במדשאה החיידקית3.

הפלקה של וירוסים מן החי פיגרה במחקר המרגש שנערך עם בקטריופאג’ים, בעיקר משום שהשיטות הנדרשות לגידול תאי יונקים בתרבית לא פותחו עד שנות ה-40 של המאה ה-20. עם זאת, הופעתם של תאי מורין גדלים בהיעדר האורגניזם המארח כולו4 הולידה עידן חדש ביכולת לתרבות ולספור וירוסים. עבודה זו הורחבה עבור התפשטות וכמות של וירוס אנצפלומליטיס סוס מערבי בתאי עוף ופוליו וירוס בתאים אנושיים5,6. ככל שתחום תאי היונקים הפולחניים התרחב, החבורה של תאים מארחים שונים לזיהומים ויראליים שונים העניקה לעולם שפע של אפשרויות לחקור כל מיני וירוסים7. זה כלל את ההתפשטות והכימות של הרפס-וירוסים אנושיים, במיוחד וירוס הרפס סימפלקס-1 (HSV-1) ו -2 (HSV-2), הגורמים נגעים mucocutaneous8. חשוב לציין, כל בדיקות הפלאק תלויות בקיומם של נגיפים חיים, שיכולים להיכנס לתאים מארחים באופן בתיווך קולטן במדגם9. ללא קשר בכל מקום ושפע של פרסומים על ביצוע בדיקות פלאק5,10,11,11,12,13,14,15,16, שיטות אלה עבור HSV-1/-2 הן תערובת של אמנות ומדע; אי אפשר לנהל את הבדיקה ללא תשומת לב ראויה לכל פרט בפרוטוקול, וגם לא ניתן לבצע בדיקה מוצלחת ללא עין קרטית לעידון בתהליך. כתב יד זה מתאר את אחת השיטות הניתנות לשחזור באופן עקבי ביותר עבור בדיקות פלאק HSV-1/-2, עם פרטים מדויקים כלפי אמנות הבדיקה שנדונים לעתים רחוקות.

פרוטוקול נוכחי זה מקבל ספירות יחידות יוצרות פלאק חי (PFU) עבור HSV-1 ו- -2 באופן אמין. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות באמצעות תאי Vero (תאי אפיתל כליות קוף ירוק אפריקאי שעברו טרנספורמציה) במעבר נמוך (מתחת למעבר מספר 155) וגדלים באופן שגרתי באלפא-MEM17 בתוספת סרום עגל עוברי 10% (FCS), L-אלניל-L-גלוטמין, ותערובת אנטיביוטית/אנטי-מיקרוטית18. תאי Vero מופצים באופן סטנדרטי במדיום זה פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע בדילול של 1/5 בכל פעם.

Protocol

כל ההליכים עם תאי Vero והרפסוירוסים חיים אושרו על ידי ועדת הביו-בטיחות המוסדית של אוניברסיטת טוסון. ערכה כללית של הליכים אלה מיוצגת באיור 1. 1. זריעת תאי Vero יום לפני תחילת בדיקת הפלאק, טריפסינציה תאי Vero resuspened אותם רגילים של Dulbecco שונה נשרים בינוני (D…

Representative Results

טבלה 1 מציגה ניסוי בעל תוצאות מיטביות. כל הדילולים פי 10 באים בעקבות ירידה של פי 10 בספירת הפלאק. נתונים מסוג זה ניתן לראות גם באיור 2, בדיקת פלאק בפועל שבה מספר הלוחות הניתן לספירה נפל בטווח של 10-4 עבור כל שלושת המשכפלים. אותו הדבר ניתן לראות באיור 3</stro…

Discussion

בעוד שבדיקות פלאק ישנות כמעט כמו תרבות התאים של היונקים עצמה, נראה שלכל מעבדה יש מערכת פרוטוקולים משלה לביצוע בדיקה בסיסית זו5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לאינספור סטודנטים במעבדות שלנו (PJD ו- BJM) שעבדו איתנו לאורך השנים בשיפור שיטות אלה. תודה מיוחדת לסטן פרסון, שתחת חסותו פותחה לראשונה מתודולוגיה זו. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי אוניברסיטת טוסון פישר המכללה למדע ומתמטיקה תואר ראשון מחקר תמיכה קרן וגשרים NIGMS למענק Baccalaureate 5R25GM058264. תוכן זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

12-well plates Corning 3512
6-well plates Corning 3516
Alpha-MEM Lonza 12169F
Antibiotic/antimycotic Gibco 15240096
Crystal violet Alfa Aesar B2193214
DMEM Gibco 11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) Gibco 14190144
Fetal calf serum Millipore-Sigma TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Gibco GS07F161BA
Hemacytometer Thermo Fisher 02-671-54
Methylcellulose Millipore-Sigma 27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.) Thermo Fisher NC9645698
Trypan Blue Corning 25900CI
Trypsin Cytiva SH30042.01
Vero cells ATCC CCL-81

References

  1. Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. . Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).
  2. Mahy, B., Collier, L. . Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).
  3. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  4. Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
  5. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  6. Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
  7. Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
  8. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. . Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).
  9. Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
  10. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
  11. Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
  12. Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
  13. Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
  14. Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
  15. Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
  16. Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
  17. Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
  18. Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
  19. Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).
  20. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
  21. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
  22. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
  23. Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
  24. Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
  25. Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
  26. Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
  27. Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
  28. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  29. Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
  30. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  31. Spearman, C. The Method of ‘Right and Wrong Cases’ (Constant Stimuli) without Gauss’s formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
  32. Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).
  33. Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
  34. Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
  35. Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
  36. Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).

Play Video

Cite This Article
Sadowski, L. A., Lesko, G. M., Suissa, C., Upadhyay, R., Desai, P. J., Margulies, B. J. Plaquing of Herpes Simplex Viruses. J. Vis. Exp. (177), e62962, doi:10.3791/62962 (2021).

View Video