Le plaquage est une méthode de routine utilisée pour quantifier les virus vivants dans une population. Bien que le plaquage soit fréquemment enseigné dans divers programmes de microbiologie avec des bactéries et des bactériophages, l’affaissement des virus des mammifères est plus complexe et prend plus de temps. Ce protocole décrit les procédures qui fonctionnent de manière fiable pour le travail régulier avec les virus de l’herpès simplex.
Il existe de nombreux protocoles publiés pour apposer les virus, y compris des références dans la littérature primaire pour la méthodologie. Cependant, l’affaissement des virus peut être difficile à effectuer, nécessitant de se concentrer sur ses spécifications et son raffinement. C’est une méthode incroyablement difficile à maîtriser pour les nouveaux étudiants, principalement parce qu’elle nécessite une attention méticuleuse aux détails les plus infimes. Cette démonstration d’affaissement des virus de l’herpès simplex devrait aider ceux qui ont eu du mal à visualiser la méthode, en particulier ses nuances, au fil des ans. Bien que ce manuscrit soit basé sur les mêmes principes de la méthodologie de plaquage standard, il diffère en ce qu’il contient une description détaillée de (1) la meilleure façon de manipuler les cellules hôtes pour éviter toute perturbation pendant le processus, (2) un milieu visqueux plus utile que l’agarose pour limiter la diffusion des virions, et (3) une procédure simple de fixation et de coloration qui produit des résultats reproductibles de manière fiable. En outre, la vidéo d’accompagnement aide à démontrer les distinctions les plus fines dans le processus, qui sont souvent manquées lors de l’instruction des autres sur la réalisation des tests de plaque.
Les débuts des tests de plaque virale remontent aux premières découvertes de virus dans les années 18901. Le virus de la mosaïque du tabac a d’abord été isolé et transmis sur les feuilles de tabac, où des taches individuelles d’infection ont pu être reconnues et quantifiées comme provenant d’une seule entité virale vivante2, identifiée plus tard comme un virion2. Des études séminales ultérieures avec des bactéries et des bactériophages ont perfectionné les techniques utilisées pour plaquer ces virus, y compris les bactéries à la phase médiane de croissance logarithmique, la dilution en série d’échantillons de bactériophages et la gélose supérieure avec visualisation ultérieure de trous littéraux (plaques) dans la pelouse bactérienne3.
L’affaissement des virus animaux a pris du retard par rapport aux recherches passionnantes menées avec les bactériophages, principalement parce que les méthodes requises pour la culture de cellules de mammifères n’ont pas été développées avant les années 19404. Cependant, l’avènement de la croissance des cellules murines en l’absence de l’organisme hôte entier4 a engendré une nouvelle ère dans la capacité de cultiver et de compter les virus. Ces travaux ont été étendus pour la propagation et la quantification du virus de l’encéphalomyélite équine occidentale dans les cellules de poulet et du poliovirus dans les cellules humaines5,6. Au fur et à mesure que le domaine des cellules de mammifères cultivables s’est élargi, la multitude de cellules hôtes différentes pour diverses infections virales a donné au monde une corne d’abondance de possibilités d’étudier toutes sortes de virus7. Cela comprenait la propagation et la quantification des herpèsvirus humains, en particulier les virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1) et -2 (HSV-2), qui causent des lésions muco-cutanées8. Il est important de noter que tous les tests de plaque dépendent de l’existence de virions vivants, qui peuvent pénétrer dans les cellules hôtes de manière médiée par les récepteurs dans un échantillon9. Indépendamment de l’omniprésence et de la multitude de publications sur l’exécution des tests de plaque5,10,11,12,13,14,15,16, ces méthodes pour HSV-1/-2 sont un mélange d’art et de science; on ne peut pas effectuer le test sans une attention appropriée à chaque détail du protocole, ni exécuter un test réussi sans un œil crticial pour la subtilité dans le processus. Ce manuscrit décrit l’une des méthodes les plus reproductibles pour les tests de plaque HSV-1/-2, avec des détails précis sur l’art du test qui sont rarement discutés.
Ce protocole actuel permet d’obtenir de manière fiable le nombre d’unités formant de la plaque vivante (PFU) pour le HSV-1 et le -2. Les meilleurs résultats sont obtenus à l’aide de cellules Vero (cellules épithéliales rénal de singe vert africain transformées) à faible passage (sous le numéro de passage 155) et couramment cultivées en alpha-MEM17 complété par 10% de sérum de veau fœtal (FCS), L-alanyl-L-glutamine et un mélange antibiotique/antimycotique18. Les cellules Vero sont propagées de manière standard dans ce milieu deux à trois fois par semaine à une dilution de 1/5 à chaque fois.
Bien que les tests de plaque soient presque aussi vieux que la culture cellulaire de mammifères elle-même, il semble que chaque laboratoire ait son propre ensemble de protocoles pour exécuter ce test de base5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les innombrables étudiants de nos laboratoires (PJD et BJM) qui ont travaillé avec nous au fil des ans pour affiner ces méthodes. Un merci spécial à Stan Person, sous la tutelle duquel cette méthodologie a été développée pour la première fois. Ce travail a été partiellement soutenu par le Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support fund et NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264. Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health.
12-well plates | Corning | 3512 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
Vero cells | ATCC | CCL-81 |