Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti
Summary
Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Ortaya çıkan bakteriyel patojenlerin tanımlanması insan sağlığı ve güvenliği için kritik öneme sahiptir. Konak hücrelere bakteriyel yapışmak bakteriyel enfeksiyonlarda önemli bir adımdır ve potansiyel tehdidin ayırt edici bir özelliğidir. Bu nedenle, bakterilerin konak hücrelere yapışmasını incelemek bakteri tehdidi değerlendirmesinin bir bileşeni olarak kullanılabilir. Konak hücrelere bakteri yapışmasını numaralandırmak için standart bir yöntem, bakterileri konak hücrelerle birlikte kuluçkaya yatırmak, yapışık bakterileri hasat etmek, hasat edilen hücreleri katı ortamda kaplamak ve ardından elde edilen koloni oluşturan birimleri (CFU) saymaktır. Alternatif olarak, konak hücrelere bakteriyel yapışma immünoforezans mikroskopi tabanlı yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımları uygulamak için geleneksel stratejiler zaman alıcı ve verimsizdir. Burada yakın zamanda geliştirilen otomatik floresan mikroskopi tabanlı görüntüleme yöntemi açıklanmıştır. Yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birleştirildiğinde, yöntem konak hücrelere yapışan bakterilerin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlar. Protokolü göstermek için gram negatif Pseudomonas aeruginosa ve Gram-pozitif Listeria monocytogenes ve buna karşılık gelen negatif kontroller olmak üzere iki bakteri türü test edildi. Sonuçlar, bu yaklaşımın yapışan bakterileri hızlı ve doğru bir şekilde numaralandırmasını ve deneysel iş yüklerini ve zaman çizelgelerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.
Introduction
Bakteriyel yapışma, bakterilerin diğer hücrelere veya yüzeylere bağlandığı bir işlemdir. Bakteriyel patojenler tarafından enfeksiyonun başarılı bir şekilde kurulması, konak hücrelere yapışıklık, dokuların kolonizasyonu ve bazı durumlarda konak hücrelerin istilası1,2,3gerektirir. Ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar, son COVID-19 pandemisi4,5,6tarafından kanıtlanan büyük halk sağlığı tehditleri oluşturmaktadır. Daha da önemlisi, yeni veya gelişmekte olan patojenler genomik tabanlı yaklaşımlar kullanılarak kolayca ayırt edilemeyebilir, özellikle patojenin tespit edilmekten kaçınmak için tasarlandığı veya patojenik olarak tanımlayan genomik imzalar içermediği durumlarda. Bu nedenle, konak hücrelere bakteriyel yapışım gibi patojenliğin ayırt edici özelliklerini doğrudan değerlendiren yöntemler kullanılarak potansiyel patojenlerin tanımlanması patojen tanımlamasında kritik bir rol oynayabilir.
Konak hücrelere bakteriyel yapışma, onlarca yıldır bakteriyel patogenez mekanizmalarını değerlendirmek için kullanılmıştır1,7. Mikroskobik görüntüleme8,9 ve bakteriyel koloni oluşturan ünitenin (CFU) 10 ,11,12,13 enfeksiyon sonrası kaplama ile numaralandırılması, konak hücrelerin mikrobiyal yapışma ve/veya enfeksiyonunu test etmek için iyi geliştirilmiş iki laboratuvar yöntemidir14. Bakteri hücrelerinin mikrometre ölçek büyüklüğü göz önüne alındığında, yapışık bakteri hücrelerinin numaralandırılması genellikle gelişmiş yüksek büyütme mikroskopi tekniklerinin yanı sıra elektron mikroskopisi, genleşme mikroskopisi (ExM)15,16ve üç boyutlu görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının kullanılmasını gerektirir17 . Alternatif olarak, konak hücrelere bağlı veya içselleştirilmiş bakterilerin numaralandırması, hasat edilen bakterilerin seyreltme serisini katı agar üzerine kaplayarak ve sonuçta elde edilen CFO’lar10 , 12,13sayarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem zahmetlidir ve yüksek verimli analizler için gerekli standartlaştırılmış veya otomatik bir prosedür oluşturmada zorluklar getiren birçok manuel adım içerir18,19. Bu nedenle, konak hücre ekini değerlendirmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi alandaki geçerli sınırlamaları giderir.
Burada, yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birlikte otomatik yüksek verimli mikroskopi kullanan bu tür bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşımı göstermek için, pseudomonas aeruginosada dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel patojenlerle deneyler yapıldı, insanların, hayvanların ve bitkilerin fırsatçı bir Gram-negatif bakteriyel patojeni14,20, sık sık konak savunma fonksiyonları bozulmuş hastaların solunum yollarını kolonileştirdiği tespit edildi. Bu yaklaşım, önceki çalışmalarda açıklanan mikroskobik görüntüleme sürecini optimize etti14,20. Görüntüleme algılaması, floresan etiketli konak hücreler ve bakteriler tarafından, bunların yakınlığını hızla izlemek için basitleştirildi ve bu da bakterileri ayırt etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için mikroskopi iş yükünü önemli ölçüde azalttı. Buna ek olarak, konak hücre ve bakterilerin sayımındaki görüntülerin otomatik istatistiksel analizi, konak hücre başına yapışık bakteri sayısının oranını tahmin etmek için bakteriyel CFU kaplamanın elden deneyinin yerini almıştır. Bu yöntemin uyumluluğunu doğrulamak için Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ve Klebsiella pneumoniae gibi birden fazla bakteri türü ve konak hücre tipinin yanı sıra insan göbek ve damar endotel hücreleri (HUVEC) de test edilmiştir ve sonuçlar yöntemin çeşitliliğini ve etkinliğini desteklememektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol, konak hücrelere bakteriyel bağlanmayı numaralandırmak için otomatik bir yaklaşım açıklar. Açıklanan yaklaşımın geleneksel yöntemlere göre birkaç çekici avantajı vardır. İlk olarak, bu yaklaşım, tek tek konak hücrelere bağlı mikrobiyal patojen hücrelerinin sayısının kesin olarak ölçülmesini sağlar. Daha da önemlisi, bu niceleme zahmetli bakteriyel hasat, seri seyreltmeler, katı ortamlarda kaplama ve CFO10, 11,12</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biotek A.Ş.’den Dr. Kaite Zlotkowski’ye teknik destekleri için minnettarız. Bu çalışma Savunma Bakanlığı tarafından W911NF1920013 sözleşme numarası altında PDF, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) ve İçişleri Bakanlığı tarafından PDF’ye 140D6319C0029 sözleşme numarası altında desteklenmiştir. Bilgilerin içeriği mutlaka Hükümetin konumunu veya politikasını yansıtmaz ve resmi bir onay çıkarılmamalıdır.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
