Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras
Summary
A detecção de interações hospedeiras-bacterianas baseadas na adesão fenotípica usando imagens de rotulagem de fluorescência de alto rendimento, juntamente com métodos automatizados de análise estatística, permite uma avaliação rápida de possíveis interações bacterianas com células hospedeiras.
Abstract
A identificação de patógenos bacterianos emergentes é fundamental para a saúde e segurança humana. A adesão bacteriana às células hospedeiras é um passo essencial em infecções bacterianas e constitui uma marca de ameaça potencial. Portanto, examinar a adesão de bactérias às células hospedeiras pode ser usado como um componente da avaliação de ameaças bacterianas. Um método padrão para enumerar a adesão bacteriana às células hospedeiras é co-incubar bactérias com células hospedeiras, colher as bactérias aderentes, emplacar as células colhidas em meios sólidos e, em seguida, contar as unidades de formação de colônias resultantes (UFC). Alternativamente, a adesão bacteriana às células hospedeiras pode ser avaliada usando abordagens baseadas em microscopia de imunofluorescência. No entanto, as estratégias convencionais para a implementação dessas abordagens são demoradas e ineficientes. Aqui, um método de imagem baseado em microscopia de fluorescência automatizada recentemente desenvolvido é descrito. Quando combinado com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística, o método permite quantificação rápida de bactérias que aderem às células hospedeiras. Duas espécies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa gram-negativa e monocytogenes listeria gram-positiva e controles negativos correspondentes, foram testadas para demonstrar o protocolo. Os resultados mostram que essa abordagem enumera de forma rápida e precisa as bactérias aderentes e reduz significativamente as cargas de trabalho experimentais e cronogramas.
Introduction
A adesão bacteriana é um processo pelo qual as bactérias se ligam a outras células ou superfícies. O estabelecimento bem-sucedido de infecção por patógenos bacterianos requer adesão às células hospedeiras, colonização de tecidos e, em alguns casos, invasão de células hospedeiras1,2,3. As doenças infecciosas emergentes constituem grandes ameaças à saúde pública, como evidenciado pela recente pandemia COVID-194,5,6. É importante ressaltar que patógenos novos ou emergentes podem não ser facilmente discernidos usando abordagens genômicas, especialmente nos casos em que o patógeno foi projetado para escapar da detecção ou não contém assinaturas genômicas que o identificam como patogênico. Portanto, a identificação de potenciais patógenos utilizando métodos que avaliam diretamente marcas de patogenicidade, como a adesão bacteriana às células hospedeiras, pode desempenhar um papel crítico na identificação de patógenos.
A adesão bacteriana às células hospedeiras tem sido usada para avaliar mecanismos de patogênese bacteriana há décadas1,7. A imagem microscópica8,9 e a enumeração da unidade formadora de colônias bacterianas (UFC)10,11,12,13 por revestimento pós-infecção são dois métodos laboratoriais bem desenvolvidos para testar a adesão microbiana e/ou infecção das células hospedeiras14. Considerando o tamanho da escala de micrômetros das células bacterianas, a enumeração das células bacterianas aderentes geralmente requer o uso de técnicas avançadas de microscopia de alta ampliação, bem como abordagens de imagem de alta resolução, incluindo microscopia eletrônica, microscopia de expansão (ExM)15,16e imagem tridimensional17 . Alternativamente, a enumeração de bactérias vinculadas ou internalizadas dentro das células hospedeiras pode ser realizada emplacando a série de diluição de bactérias colhidas em ágar sólido e contando as CFUs resultantes10,12,13. Este método é trabalhoso e inclui muitas etapas manuais, o que introduz dificuldades no estabelecimento de um procedimento padronizado ou automatizado necessário para análises de alto rendimento18,19. Portanto, o desenvolvimento de novos métodos para avaliar o anexo de células hospedeiras abordaria as limitações atuais no campo.
Um desses métodos é descrito aqui que utiliza microscopia automatizada de alto rendimento, combinada com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística. Para demonstrar a abordagem, foram realizados experimentos com diversos patógenos bacterianos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, um patógeno bacteriano gram-negativo oportunista de humanos, animais e plantas14,20, que é frequentemente encontrado para colonizar o trato respiratório de pacientes com funções de defesa hospedeiras prejudicadas. Essa abordagem otimou o processo de imagem microscópica descrito em estudos anteriores14,20. A detecção de imagens foi simplificada por células hospedeiras e bactérias rotuladas por fluorescência para rastrear rapidamente a proximidade delas, o que reduziu drasticamente a carga de trabalho de microscopia para obter imagens de alta resolução para distinguir bactérias. Além disso, a análise estatística automatizada de imagens na contagem de células hospedeiras e bactérias substituiu o experimento manual de revestimento de CFU bacteriano para estimar a razão da contagem bacteriana aderente por célula hospedeira. Para confirmar a compatibilidade deste método, também foram testadas múltiplas cepas bacterianas e tipos de células hospedeiras, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, bem como células endotelias de veia umbilicais humanas (HUVECs), e os resultados apoiam a diversidade e eficácia do método.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descreve uma abordagem automatizada para enumerar o apego bacteriano às células hospedeiras. A abordagem descrita tem várias vantagens atraentes em relação aos métodos convencionais. Em primeiro lugar, essa abordagem permite a quantificação precisa do número de células de patógenos microbianas que estão ligadas a células hospedeiras individuais. É importante ressaltar que essa quantificação pode ser realizada sem a necessidade de colheita bacteriana laboriosa, diluições seriais, revestimento…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao Dr. Kaite Zlotkowski da Biotek Inc. por seu suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa sob o número do contrato W911NF1920013 para a PdF, a Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (DARPA) e o Departamento do Interior sob o contrato nº 140D6319C0029 ao PdF. O conteúdo das informações não reflete necessariamente a posição ou a política do Governo, e nenhum endosso oficial deve ser inferido.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
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