Preparação da Solução Naringenin para Aplicação In Vivo
Summary
Aqui, o protocolo apresenta o preparo da solução de naringenina para administração intraperitoneal in vivo. A naringenina é totalmente dissolvida em uma mistura de dimetilsulfóxido, Tween 80, e solução salina. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina foram avaliados por teste de glicose no sangue, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato e ensaio de imunoabsorção enzimática.
Abstract
A preparação de uma solução composta (fitoquímica) é uma etapa negligenciada, mas crítica, antes de sua aplicação em estudos como a triagem de medicamentos. A solubilização completa do composto é necessária para o seu uso seguro e resultados relativamente estáveis. Aqui, um protocolo para o preparo de solução de naringenina e sua administração intraperitoneal em uma dieta rica em gordura e modelo diabético induzido por estreptozotocina (STZ) é demonstrado como exemplo. Uma pequena quantidade de naringenina (3,52-6,69 mg) foi usada para testar sua solubilização em solventes, incluindo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) e DMSO mais Tween 80 reconstituído em solução salina fisiológica (PS), respectivamente. A solubilização completa do composto é determinada observando a cor da solução, a presença de precipitados após a centrifugação (2000 x g por 30 s) ou permitindo que a solução permaneça por 2 h à temperatura ambiente (RT). Após a obtenção de um composto estável/solução fitoquímica, a concentração/quantidade final do composto necessária para estudos in vivo pode ser preparada numa solução-mãe apenas com solvente (sem PS) e, em seguida, diluída/misturada com PS conforme desejado. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina em camundongos (administração intraperitoneal a 20 mg/kg de p.c., 2 mg/mL) foram avaliados pela medição da glicemia, massa óssea (micro-TC) e taxa de reabsorção óssea (coloração TRAP e ELISA). Os pesquisadores que procuram preparações detalhadas de soluções orgânicas / fitoquímicas se beneficiarão dessa técnica.
Introduction
Com o aumento dos estudos sobre o uso de compostos fitoquímicos para triagem de medicamentos, vale a pena dar atenção às abordagens para preparar soluções fitoquímicas para avaliar seus efeitos ótimos. Muitos aspectos, como a metodologia de dissolução, dosagem e concentração, devem ser considerados ao preparar o composto1.
A dissolução à base de solvente é amplamente utilizada para a preparação de compostos orgânicos1. Os solventes comumente usados incluem água, óleo, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Embora uma suspensão com substâncias não dissolvidas seja aceitável quando o composto é administrado por gavagem gástrica, um soluto totalmente dissolvido é crítico para administração intravenosa. Como a solução oleosa, a suspensão e a emulsão podem causar embolias capilares, sugere-se uma solução aquosa para o preparo de compostos, especialmente quando se administram injeções intravenosas, intramusculares e intraperitoneais3.
A faixa de dose efetiva varia entre os compostos e até mesmo entre as doenças tratadas com o mesmo composto. As determinações da dose efetiva e segura e da concentração dependem da literatura e de experimentos preliminares4. Aqui, a preparação do composto naringenina é demonstrada como um exemplo.
A naringenina (4,5,7-trihidroxi-flavanona), um composto polifenólico, tem sido estudada no tratamento da doença por suas atividades hepatoprotetoras5, antidiabéticas6, anti-inflamatórias7 e antioxidantes8. Para aplicações in vivo, a administração oral de naringenina é comumente usada. Estudos prévios relataram o preparo de solução de naringenina em carboximetilcelulose a 0,5%-1%, dose de metilcelulose a 0,5%, DMSO a 0,01% e solução salina fisiológica (PS) a 50-100 mg/kg, administrada por gavagem oral 9,10,11,12. Além disso, outros estudos relataram a suplementação de naringenina com ração a 3% (em peso/m) para ingestão oral na dose de 3,6 g/kg/d13,14. Estudos também relataram o uso de etanol (0,5% v/v), PS e DMSO para dissolver naringenina para injeção intraperitoneal a 10-50 mg/kg15,16,17,18. Em um estudo de epilepsia do lobo temporal, camundongos receberam uma injeção de naringenina suspensa em carboximetilcelulose a 0,25% dissolvida em PS19. Embora esses estudos relatem o uso de diferentes solventes para preparar soluções de naringenina, mais detalhes, como o estado de dissolução e a resposta animal, não foram relatados.
Este protocolo introduz um procedimento para preparar solução de naringenina para aplicação in vivo na osteoporose induzida por diabetes. A preparação da solução injetável inclui a preparação de solventes e compostos, estimativa de dosagem, processo de dissolução e filtração. A dosagem foi determinada com base em pesquisas bibliográficas e experimentos preliminares, monitorando camundongos após a administração de injeções todos os dias durante 3 dias e modificando a dosagem de acordo com os comportamentos dos camundongos. A concentração final escolhida (20 mg/kg de p.c.) foi administrada por via intraperitoneal 5 dias por semana durante 8 semanas em uma dieta rica em gordura e camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Os efeitos da naringenina na osteoporose diabética foram avaliados por meio de testes de glicose no sangue, micro-TC, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e ensaio imunoenzimático (ELISA).
No geral, observou-se que a naringenina em uma faixa de concentração de 40-400 mg/mL não se dissolveu completamente em etanol ou DMSO ou 5% (etanol ou DMSO) mais 95% PS (v/v). No entanto, a naringenina se dissolveu completamente em uma mistura de 3,52% de DMSO, 3,52% de Tween 80 e 92,96% de PS. O procedimento detalhado ajudará os pesquisadores a preparar o composto como uma solução de injeção para aplicação in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A preparação de solução fitoquímica é a base para a sua aplicação in vivo. Neste protocolo, o preparo da solução de naringenina foi demonstrado por meio do uso de diferentes solventes, como etanol, DMSO, Tween 80 e PS a 0,9%. A solução em estado completamente dissolvido precisa ser monitorada ainda mais, permitindo que permaneça à temperatura ambiente por algumas horas prolongadas e, em seguida, filtrada antes de ser usada in vivo.
A determinação de solventes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973607 e 81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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