Preparazione della soluzione di Naringenin per l'applicazione in vivo
Summary
Qui, il protocollo presenta la preparazione della soluzione di naringenina per la somministrazione intraperitoneale in vivo . La naringenina è completamente sciolta in una miscela di dimetilsolfossido, Tween 80 e soluzione salina. Gli effetti osteoporotici antidiabetici della naringenina sono stati valutati mediante test della glicemia, colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati e saggio immunoassorbente enzimatico.
Abstract
La preparazione di una soluzione composta (fitochimica) è un passaggio trascurato ma critico prima della sua applicazione in studi come lo screening farmacologico. La completa solubilizzazione del composto è necessaria per il suo uso sicuro e risultati relativamente stabili. Qui, un protocollo per la preparazione della soluzione di naringenina e la sua somministrazione intraperitoneale in una dieta ricca di grassi e un modello diabetico indotto da streptozotocina (STZ) è dimostrato come esempio. Una piccola quantità di naringenina (3,52-6,69 mg) è stata utilizzata per testare la sua solubilizzazione in solventi, tra cui etanolo, dimetilsolfossido (DMSO) e DMSO più Tween 80 ricostituito in soluzione fisiologica (PS), rispettivamente. La completa solubilizzazione del composto viene determinata osservando il colore della soluzione, la presenza di precipitati dopo la centrifugazione (2000 x g per 30 s) o lasciando riposare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente (RT). Dopo aver ottenuto un composto stabile/soluzione fitochimica, la concentrazione/quantità finale del composto necessaria per gli studi in vivo può essere preparata in una soluzione madre di solo solvente (senza PS) e quindi diluita/miscelata con PS come desiderato. Gli effetti osteoporotici antidiabetici della naringenina nei topi (somministrazione intraperitoneale a 20 mg/kg p.c., 2 mg/ml) sono stati valutati misurando la glicemia, la massa ossea (micro-CT) e la velocità di riassorbimento osseo (colorazione TRAP ed ELISA). I ricercatori alla ricerca di preparazioni dettagliate di soluzioni organiche / fitochimiche trarranno beneficio da questa tecnica.
Introduction
Con l’aumento degli studi sull’uso di composti fitochimici per lo screening dei farmaci, vale la pena prestare attenzione agli approcci per preparare soluzioni fitochimiche per valutare i loro effetti ottimali. Molti aspetti come la metodologia di dissoluzione, il dosaggio e la concentrazione devono essere considerati quando si prepara il composto1.
La dissoluzione a base di solvente è ampiamente utilizzata per la preparazione di composti organici1. I solventi comunemente usati includono acqua, olio, dimetilsolfossido (DMSO), metanolo, etanolo, acido formico, Tween, glicerina, ecc2. Sebbene una sospensione con sostanze non disciolte sia accettabile quando il composto viene somministrato mediante sonda gastrica, un soluto completamente disciolto è fondamentale per la somministrazione endovenosa. Poiché la soluzione oleosa, la sospensione e l’emulsione possono causare embolie capillari, si suggerisce una soluzione acquosa per la preparazione del composto, specialmente quando si somministrano iniezioni endovenose, intramuscolari e intraperitoneali3.
L’intervallo di dosaggio efficace varia tra i composti e anche tra le malattie trattate con lo stesso composto. Le determinazioni della dose efficace e sicura e della concentrazione dipendono dalla letteratura e dagli esperimenti preliminari4. Qui, la preparazione del composto naringenina è dimostrata come esempio.
La naringenina (4,5,7-triidrossi-flavanone), un composto polifenolico, è stata studiata nel trattamento della malattia per le sue attività epatoprotettive5, antidiabetiche6, antinfiammatorie7 e antiossidanti8. Per le applicazioni in vivo, la somministrazione orale di naringenina è comunemente usata. Studi precedenti hanno riportato la preparazione di una soluzione di naringenina in carbossimetilcellulosa allo 0,5%-1%, dose di metilcellulosa allo 0,5%, DMSO allo 0,01% e soluzione fisiologica (PS) a 50-100 mg/kg, somministrata mediante sonda gastrica orale 9,10,11,12. Inoltre, altri studi hanno riportato l’integrazione di naringenina con chow al 3% (wt/wt) per assunzione orale alla dose di 3,6 g/kg/die13,14. Gli studi hanno anche riportato l’uso di etanolo (0,5% v / v), PS e DMSO per sciogliere la naringenina per iniezione intraperitoneale a 10-50 mg / kg15,16,17,18. In uno studio sull’epilessia del lobo temporale, i topi hanno ricevuto un’iniezione di naringenina sospesa in carbossimetilcellulosa allo 0,25% disciolta in PS19. Sebbene questi studi riportino l’uso di diversi solventi per preparare soluzioni di naringenina, ulteriori dettagli, come lo stato di dissoluzione e la risposta animale, non sono stati riportati.
Questo protocollo introduce una procedura per la preparazione della soluzione di naringenina per l’applicazione in vivo nell’osteoporosi indotta da diabete. La preparazione della soluzione iniettabile comprende la preparazione di solventi e composti, la stima del dosaggio, il processo di dissoluzione e la filtrazione. Il dosaggio è stato determinato sulla base della ricerca bibliografica e di esperimenti preliminari monitorando i topi dopo aver somministrato iniezioni ogni giorno per 3 giorni e modificando il dosaggio in base ai comportamenti del topo. La concentrazione finale scelta (20 mg/kg p.c.) è stata somministrata per via intraperitoneale 5 giorni alla settimana per 8 settimane in una dieta ricca di grassi e topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ)20,21. Gli effetti della naringenina nell’osteoporosi diabetica sono stati valutati mediante test della glicemia, micro-CT, colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
Nel complesso, è stato osservato che la naringenina in un intervallo di concentrazione di 40-400 mg/ml non si dissolve completamente né in etanolo né in DMSO né al 5% (etanolo o DMSO) più il 95% di PS (v/v). Tuttavia, la naringenina si è sciolta completamente in una miscela di 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 e 92,96% PS. La procedura dettagliata aiuterà i ricercatori a preparare il composto come soluzione di iniezione per l’applicazione in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparazione della soluzione fitochimica è la base per la sua applicazione in vivo. In questo protocollo, la preparazione della soluzione di naringenina è stata dimostrata utilizzando diversi solventi, come etanolo, DMSO, Tween 80 e 0,9% PS. La soluzione in stato completamente disciolto deve essere ulteriormente monitorata lasciandola rimanere a temperatura ambiente per alcune ore prolungate, e quindi filtrata prima di essere utilizzata in vivo.
La determinazione del sol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81973607 e 81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
