이 프로토콜은 마취마우스에 있는 가까운 혈관에서 백혈구 및 혈류 데이터를 심신하는 두뇌에서 형광 칼슘 심상을 취득하고 분석하는 단계를 제시합니다. 이러한 기술은 벽화 세포 생리학의 연구에 유용하며 모든 세포 유형의 칼슘 과도를 조사하기 위해 적응 할 수 있습니다.
단백질 생물학및 마우스 유전학에 있는 최근 어드밴스는 생체내 뇌 세포의 세포내 칼슘 변동을 측정하고 현지 혈역학과 상관관계를 가능하게 했습니다. 이 프로토콜은 만성 두개골 창으로 준비된 형질전환 마우스를 사용하고 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표인 RCaMP1.07을 α 부드러운 근육 액틴 프로모터하에서 혈관 의 부드러운 근육 세포 및 천신 성 동맥과 같은 벽화 세포를 구체적으로 라벨링합니다. 단계는 혈액 흐름을 추적하기 위해 형광 염료의 정맥 주사를 위한 꼬리 정맥 카테터를 준비하는 방법뿐만 아니라 뇌 백혈구 칼슘 및 국부 혈관 혈역학 (직경, 적혈구 속도 등)을 측정하는 방법에 대해 설명되어 있습니다. 마지막으로, 2018년 Barrett 외에서 개발한 이미지 처리 알고리즘을 통해 칼슘 변동 및 혈류 영화의 분석을 위해 세부 사항이 제공되며, 이러한 프로세스가 다른 세포 이미징 데이터에 어떻게 적응할 수 있는지에 중점을 두고 있습니다.
중추 신경계 혈관은 관통하는 동맥, 모세 혈관 및 오름차순 정맥으로 구성됩니다. 이 네트워크 내에서, 혈관 평활근 세포와 같은 벽화 세포는 제1 동맥 가지 및 모세 혈관1을따라 세포 과정을 확장한다. Pericytes는 혈액-뇌 장벽1,2,이동 및운동성3,잠재적 줄기 세포 특성 및 뇌 혈류량4,5,6의조절의 유지를 포함하여 뇌 내에서 여러 가지 역할을 갖는 것으로 보인다. pericytes의 기능적 역할의 대부분은 이들 세포의 팽창 또는 수축을 조절할 수 있는 세포내 칼슘의 변동에 연결되어4,5,6.
몇몇 최근 연구는 두뇌 pericytes7의다른 모형을 확인하기 위한 기준을설정했습니다 7,8. 관통하는 동맥의 처음 4개 가지 내의 벽화 세포는 수축 단백질 α-부드러운 근육 액틴(αSMA)과 혈관7,8,9를감싸는 공정을 통해 돌출, 오보이드 소마타의 발현에 기초하여 pericytes를 천신시키고 있다. 이 프로토콜은 천신 성 과구의 칼슘 변동을 시각화하기 위해 Tg (RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik /J10으로알려진 새로운 형질형 마우스 라인 인 Acta2-RCaMP1.07을 사용합니다. 이 마우스는 적색 유전적으로 인코딩된 칼슘 표시기, RCaMP1.07을 αSMA 발현 세포(혈관 의 매끄러운 근육 세포 및 천신 성 동맥)에서 표현한다. 사육 식민지는 헤미지고테스와 비 캐리어 동물을 건너 유지됩니다. RCaMP1.07은 칼모둘린 결합 도메인을 가진 적색 형광 단백질로, 세포내칼슘(10)및11에결합할 때 형광을 증가시킨다. 이 프로토콜은 형광염료의 꼬리 정맥 주입, 마취 마우스의 현미경 이미지 수집, 프로그래밍 플랫폼을 사용하여 데이터 분석을 포함하여 2개의 광자 현미경 검사법에 의한 천식 성구 및 혈류 측정의 결합된 칼슘 이미징단계를 간략하게 설명합니다(그림1). 이러한 기술은 벽화 세포 생리학에 대 한 질문을 해결 하기 위해 유용 하지만 뇌 또는 다른 장기 시스템에 있는 모든 세포 모형에 칼슘 과도 를 공부 하도록 적응될 수 있다.
10개월 된 여성 Acta2-RCaMP1.07 마우스가 이 문서에서 제시된 실험에 사용되었습니다. 마우스는 만성 두개골 창 및 머리 포스트 이식 2 개월 전에 수술을 받았다. 수술 프로토콜에 대한 세부 사항은 이전 연구에서 논의된다12,13 유사한 절차는 이전에 출판 된 다른 프로토콜에서 수행되었다14,15. 혈관분기는 정맥 주사녹색 형광술-Dextran (70,000 MW, 애니온 용액, 2.5 % w /v)로 표시됩니다. 이 염료는 비용 효과적이고 상용 소스에서 쉽게 구할 수 있지만 RCaMP 방출과 겹치고 현미경 이미지 수집 중에 출혈 될 수있는 더 넓은 방출 스펙트럼을 가지고 있습니다. 스펙트럼 언믹싱을 위한 단계는 이를 우회하기 위해 아래 섹션 4에 설명되어 있지만 EGFP를 기반으로 하는 것과 같이 더 좁은 배출 스펙트럼을 가진 다른 녹색 염료도 사용될 수 있습니다.
본 방법은 깊이 스택을 위한 카테터, 2광자 현미경 이미지 수집, 세포 칼슘 신호 영상 생성, 혈역학 키모그래프 생성, 당사의 이미지 처리알고리즘(그림 1)을 이용한 칼슘 및 혈역학 분석을 통해 마우스 꼬리 정맥 주입에 대한 세부 정보를 제공한다(그림 1). 이러한 기술에는 생체 내 이미징 결과를 개선하고 세션 중에 시간, 자원 및 동물 스트레스를 줄이는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 꼬리 정맥 주입을 위한 카테터의 사용은 바늘, 주사기 및 마우스의 순환에 주입된 물질의 양을 더 많은 제어를 제공합니다. 또한, 그것은 꼬리 조직에 염료 주입을 방지, 비싼 시약을 절약. 둘째, 우리는 회신 백혈구에 유전으로 인코딩 된 칼슘 센서를 발현하는 트랜스 제닉 마우스를 사용하고 후속 이미징 세션에서 세포 식별 및 이전을 용이하게하는 깊이 z-스택으로 뇌 혈관 네트워크 내에서 국한하는 방법을 보여줍니다. 이것은 pericyte 연구 결과에 있는 중요한 요인이고 적당한 세포분류를6,7를보장합니다. 셋째, 당사는 동적 세포 신호를 측정하기 위한 좋은 출발점인 칼슘 영화와 혈역학 적 선 스캔 데이터를 수집하기 위한 매개 변수를 제공합니다. 마지막으로 이미지 사전 처리(스펙트럼 언믹싱), 칼슘 이미지 분석 및 혈역학 분석(직경, 속도 등)을 위한 여러 가지 접근 방식을 포함하는 포괄적인 이미지 처리 툴박스인 이미지 처리알고리즘(17)을소개합니다. 이러한 알고리즘은 데이터를 빠르고 쉽게 시각화할 수 있도록 플롯을 생성하는 동시에 결과를 분석하는 데 필요한 사용자 전문 지식 수준을 최소화할 수 있습니다. 또한 몇 줄의 코드로 자동화하여 동일한 매개 변수로 여러 데이터 집합을 신속하게 일괄 처리할 수 있습니다. 이를 통해 데이터 시각화와 연구원의 시간 투자를 잠재적으로 향상시킬 수 있습니다.
좋은 칼슘 이미징 데이터를 수집하는 열쇠는 명확한 형광 신호 수집을 위해 레이저 전력 및 PMT 설정을 조정하는 것이지만 전체 칼슘 이벤트를 캡처하기에 충분한 프레임 속도로 데이터를 수집하는 것입니다. 이 프로토콜의 데이터는 초당 10-11 프레임으로 획득되었으며, 이는 흡입 백혈구에서 느린 칼슘 진동을 포착합니다. 분석 중에 분석 결과를 개선할 수 있는 몇 가지 단계도 있습니다. 첫째, 스펙트럼 언믹싱은 형광의 방출 스펙트럼 사이에 상당한 중첩이 있는 경우 유익하다(도2). 플루오레세인-엑스트라넨은 혈역학측정에일반적으로 사용되는 비용 효율적이고 시판되는 dextran 컨쥬게이트이기 때문에 이 프로토콜에 사용되었다. 스펙트럼 언믹스는 칼슘 신호의 향상된 검출을 위한 데이터를 정리하는 것을 돕습니다, 그러나 더 좁은 방출 스펙트럼을 가진 대체 형광은 또한 사용될 수 있었습니다. 둘째, ROI(도3)로세포 구조를 직접 선택하는 것은 소마 또는 공정 분기와 같은 상이한 세포 영역에서 칼슘 이벤트를 분류하는 데 유용하다. 활동 기반 ROI 선택(그림 4)16개별 칼슘 이벤트에 대한 보다 많은 공간 및 측량 정보를 제공한다. 이것은 주어진 지역에 있는 칼슘 사건의 빈도 또는 그밖 세포 지역에 사건의 전파를 결정할 때 도움이 될 수 있습니다. 이미징 데이터를 분석하기 위해 프로그래밍 소프트웨어를 사용하면 데이터가 일괄 처리될 때 연구원의 시간을 절약할 수 있지만 최적의 결과를 위해 매개 변수를 조정하려면 초기 시간 투자가 필요합니다. 가장 중요한 요소는 활성 영역의 예상 크기(μm2)와신호의 지속 시간(최소 신호 시간 및 최대 신호 시간을 정의해야 합니다)입니다. 연구원은 데이터에 맞는 매개 변수를 가장 잘 결정하기 위해 먼저 몇 가지 예 T 시리즈 영화를 검사해야합니다. 마지막으로, 현미경에서 획득한 품질이 좋지 않는 데이터는 칼슘 및 혈역학의 분석을 크게 방해할 수있습니다(그림 6). 따라서, 초기에 현미경 획득 설정을 최적화하기 위해주의를 기울여야 한다. 이러한 요인을 염두에 두고, 다른 조직 또는 세포 유형에서 다른 동적 세포 신호(예: 형광나트륨, 칼륨, 대사 산물 또는 전압 변동)의 칼슘 이미징 또는 분석에 맞게 조정할 수 있는 이 프로토콜.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 데이터는 뇌 활동에 영향을 미치고 혈류에 영향을 미칠 수있는 마취 하에 수집됩니다. 유사한 화상 진찰은 더 생리적인 결과를 위한 머리 고정을 받아들이기 위하여 훈련된 깨어 있는 마우스에서 행해질 수 있습니다. 또한 생체 내에서3차원 세포및 혈관의 2차원 이미지를 수집한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 한 번에 혈관의 단일 단면에 있는 이 세포 또는 혈류 내의 칼슘 사건의 파벌을 포착할 수 있습니다.
주목할 또 다른 제한사항은 2광자 칼슘 이미징이 초점 비행기 안팎의 움직임이 칼슘 변동으로 오인될 수 있는 모션 아티팩트에 민감하다는 것입니다. 이 프로토콜은 동물의 움직임을 제한하는 마취 하에 수행되었습니다. 그러나, 모션 아티팩트는 마우스의 호흡 속도, 심박수, 가능한 조직 부종, 및 복신의 경우, 혈관 수축 또는 혈관 수축 4,6,18,19에의해 도입될 수 있다. 모션 아티팩트는 여러 전략에 의해 완화될 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 이미지 프로세싱 패키지에는 2D 컨볼루션 엔진을 사용하여 보이는혈관(13,17)을기반으로 T 시리즈 내의 이미지를 정렬하는 선택적 모션 보정 단계가 포함됩니다. 초점 평면에 중요한 변화가 있는 프레임은 이 알고리즘에 의해 식별되며 분석에서 제외될 수 있습니다. 또한, 형광 흔적을 생성할 때 Z-점수와 같은 이미징 처리 패키지 내에서 통계적 전략을 사용하여 운동을 정상화할 수있다(20). 2광자 이미징에서 모션 아티팩트를 고려하는 가장 강력한 접근법은 칼슘 표시기(예를 들어, GCaMP)와 칼슘 독립적인 형광 기자(예를 들어, mCherry)와 같은 세포 내의 두 형광 지표의 발현을 결합하는 것입니다. 형광 기자의 변동은 운동에 기인할 수 있고 운동 아티팩트를 정상화하기 위하여 칼슘 표시기 신호에서 빼기 위하여.
이 프로토콜의 목적은 생체 내에서 최적의 칼슘 이미징 및 혈류 데이터를 수집하는 방법에 대한 명확한 이해를 제공하고 연구자가 결과를 개선하기 위해 구현할 수 있는 새로운 방법과 분석 도구를 제시하는 것입니다. 이 기술은 혈류 통제 또는 다른 두뇌 질병 상태에서 다른 pericytes 인구의 역할을 연구하기 위하여 적용될 수 있습니다. 이 화상 진찰 매개 변수는 또한 그밖 세포 모형 및 기관 시스템에서 칼슘 과 혈류를 연구하기 위하여 이용될 수 있고 유사한 원리는 칼슘을 넘어 그밖 유전으로 인코딩된 센서에 의해 가능하게 되는 그밖 동적 화상 진찰 기술에 적용됩니다.
The authors have nothing to disclose.
J. 메자는 미틱스와 연구 매니토바의 펠로우십에 의해 지원됩니다. 이 사업을 위한 기금은 건강 캐나다와 아즈릴리 재단의 재정 지원을 통해 매니토바와 뇌 캐나다 대학에서 시작 자금, 연구 매니토바, 매니토바 의료 서비스 재단, 신생 기금에 의해 제공되었다. 여기에 표현된 견해는 반드시 보건부 장관이나 캐나다 정부의 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |