Dit protocol presenteert stappen om fluorescerende calciumbeelden van hersenverwarmende pericyten en bloedstroomgegevens van nabijgelegen bloedvaten in verdoofde muizen te verkrijgen en te analyseren. Deze technieken zijn nuttig voor studies van de fysiologie van muurschilderingscellen en kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype te onderzoeken.
Recente ontwikkelingen in de eiwitbiologie en muisgenetica hebben het mogelijk gemaakt om intracellulaire calciumfluctuaties van hersencellen in vivo te meten en dit te correleren met lokale hemodynamiek. Dit protocol maakt gebruik van transgene muizen die zijn bereid met een chronisch schedelvenster en de genetisch gecodeerde calciumindicator, RCaMP1.07, tot expressie brengen onder de α-gladde spieractinepromotor om specifiek muurschilderingcellen te labelen, zoals vasculaire gladde spiercellen en ensheathing pericyten. Stappen worden beschreven voor het bereiden van een staartaderkatheter voor intraveneuze injectie van fluorescerende kleurstoffen om de bloedstroom te traceren, evenals hoe hersenpericytencalcium en lokale bloedvathemodynamiek (diameter, rode bloedcelsnelheid, enz.) te meten door twee fotonenmicroscopie in vivo door het schedelvenster in ketamine / xylazine-verdoofde muizen. Ten slotte worden details verstrekt voor de analyse van calciumfluctuaties en bloedstroomfilms via de beeldverwerkingsalgoritmen ontwikkeld door Barrett et al. 2018, met de nadruk op hoe deze processen kunnen worden aangepast aan andere cellulaire beeldvormingsgegevens.
De vasculatuur van het centrale zenuwstelsel bestaat uit doordringende arteriolen, haarvaten en opgaande venules. Binnen dit netwerk, muurschildering cellen zoals vasculaire gladde spiercellen omhullen arteriolen en pericyten breiden cellulaire processen langs de eerste arteriole takken en haarvaten1. Pericyten lijken verschillende rollen in de hersenen te hebben, waaronder het onderhoud van de bloed-hersenbarrière1,2,migratie en beweeglijkheid3,potentiële stamceleigenschappen en de regulatie van de bloedstroom in de hersenen4,5,6. Veel van de functionele rollen van pericyten zijn in verband gebracht met fluctuaties in intracellulair calcium die de verwijding of contractie van deze cellen kunnen reguleren4,5,6.
Verschillende recente studies hebben criteria vastgesteld voor het identificeren van verschillende soorten hersenpericyten7,8. Muurschilderingcellen binnen de eerste 4 takken van penetrerende arteriolen zijn ensheathing pericyten op basis van hun expressie van het contractiele eiwit α-gladde spier actine (αSMA) en hun uitstekende, eivormige somata met processen die zich rond bloedvatenwikkelen 7,8,9. Om calciumfluctuaties in ensheathing pericyten te visualiseren, gebruikt dit protocol een nieuwe transgene muislijn, Acta2-RCaMP1.07, ook bekend als Tg (RP23-370F21-RCaMP1.07) B3-3Mik / J10. Deze muizen drukken de rode genetisch gecodeerde calciumindicator, RCaMP1.07, uit in αSMA-expressiecellen (vasculaire gladde spiercellen en ensheathing pericyten). Fokkolonies worden in stand gehouden door niet-carrierdieren te kruisen met hemizygoten. RCaMP1.07 is een rood fluorescerend eiwit met een calmoduline bindend domein, dat de fluorescentie verhoogt bij binding aan het intracellulaire calcium10,11. Dit protocol schetst de stappen voor gecombineerde calciumbeeldvorming van ensheathing pericyten en bloedstroommetingen door twee fotonmicroscopie inclusief procedures voor staartaderinjectie van fluorescerende kleurstoffen, microscoopbeeldacquisitie bij verdoofde muizen en data-analyse met programmeerplatforms (figuur 1). Deze technieken zijn nuttig voor het beantwoorden van vragen over de fysiologie van muurschilderingcellen, maar kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype in de hersenen of een ander orgaansysteem te bestuderen.
Een 10 maanden oude vrouwelijke Acta2-RCaMP1.07 muis werd gebruikt voor het experiment gepresenteerd in dit artikel. De muis onderging twee maanden eerder een operatie voor chronische schedelvenster- en hoofdimplantatie na implantatie. Details voor het chirurgische protocol worden besproken in eerdere studies12,13 en soortgelijke procedures zijn uitgevoerd in andere eerder gepubliceerde protocollen14,15. De vasculatuur wordt gelabeld met groene fluoresceïne-Dextran (70.000 MW, anionische oplossing, 2,5% w/v) intraveneus geïnjecteerd. Deze kleurstof is kosteneffectief en gemakkelijk verkrijgbaar bij commerciële bronnen, maar het heeft een breder emissiespectrum dat kan overlappen met RCaMP-emissie en doorbloedt tijdens het verkrijgen van microscoopbeelden. Stappen voor spectraal onmengen worden beschreven in punt 4 hieronder om dit te omzeilen, maar andere groene kleurstoffen met smallere emissiespectra, zoals die op basis van EGFP, kunnen ook worden gebruikt.
De huidige methode biedt details over muisstaartaderinjectie met een katheter, twee-foton microscoopbeeldacquisitie voor dieptestapels, celcalciumsignaleringsfilms, creatie van hemodynamische kymografen en calcium- en hemodynamische analyse met onze beeldverwerkingsalgoritmen17 (Figuur 1). Er zijn verschillende voordelen aan deze technieken die het in vivo beeldvormingsresultaat verbeteren en tijd, middelen en dierlijke stress tijdens de sessie verminderen. Ten eerste biedt het gebruik van een katheter voor staartaderinjectie meer controle over de naald, de spuit en de hoeveelheid stof die in de circulatie van de muis wordt geïnjecteerd. Bovendien voorkomt het kleurstofinjectie in het staartweefsel, waardoor dure reagentia worden bespaard. Ten tweede gebruiken we transgene muizen die genetisch gecodeerde calciumsensoren tot expressie brengen in ensheathing pericyten en demonstreren hoe ze te lokaliseren in het vasculaire netwerk van de hersenen met een diepte z-stack, wat celidentificatie en verplaatsing in daaropvolgende beeldvormingssessies op lange termijn vergemakkelijkt. Dit is een belangrijke factor in pericytenstudies en zorgt voor een goede celclassificatie6,7. Ten derde bieden we onze parameters voor het verzamelen van calciumfilms en hemodynamische lijnscangegevens die een goed startpunt zijn voor het meten van dynamische cellulaire signalen. Ten slotte presenteren we onze beeldverwerkingsalgoritmen17, een uitgebreide toolbox voor beeldverwerking die meerdere benaderingen bevat voor beeldvoorbewerking (zoals spectraal onmengen), calciumbeeldanalyse en hemodynamische analyse (diameter, snelheid, enz.). Deze algoritmen kunnen plots genereren voor een snelle en eenvoudige visualisatie van de gegevens, terwijl het niveau van gebruikersexpertise dat nodig is om de resultaten te analyseren, wordt geminimaliseerd. Bovendien kan het worden geautomatiseerd met een paar regels code om snel meerdere datasets met dezelfde parameters te verwerken. Dit kan mogelijk de datavisualisatie en de tijdsinvestering van de onderzoeker verbeteren.
De sleutel tot het verzamelen van goede calciumbeeldvormingsgegevens is het aanpassen van het laservermogen en de PMT-instellingen voor duidelijke fluorescentiesignaalacquisitie, maar ook om gegevens te verzamelen met een voldoende framesnelheid om de hele calciumgebeurtenis vast te leggen. De gegevens in dit protocol werden verkregen met 10-11 frames per seconde, die de langzamere calciumoscillaties in ensheathing pericyten vangt. Er zijn ook verschillende stappen tijdens de analyse die de analyse-uitkomst kunnen verbeteren. Ten eerste is spectraal ontmenging gunstig als er een significante overlap is tussen de emissiespectra van fluoroforen (figuur 2). Fluoresceïne-dextran werd in dit protocol gebruikt omdat het een kosteneffectief en in de handel verkrijgbaar dextran-conjugaat is dat vaak wordt gebruikt voor hemodynamische metingen5. Spectrale ontmenging helpt om de gegevens op te ruimen voor verbeterde detectie van calciumsignalen, maar alternatieve fluoroforen met smallere emissiespectra kunnen ook worden gebruikt. Ten tweede is het met de hand selecteren van cellulaire structuren als ROIs (Figuur 3) nuttig voor het classificeren van calciumgebeurtenissen in verschillende subcellulaire regio’s zoals de soma of procestakken. Activiteitsgebaseerde ROI-selectie(figuur 4)16 biedt meer ruimtelijke en temporele informatie over individuele calciumgebeurtenissen. Dit kan nuttig zijn bij het bepalen van de frequentie van calciumgebeurtenissen in een bepaald gebied of de voortplanting van gebeurtenissen naar andere cellulaire gebieden. Het gebruik van programmeersoftware om beeldgegevens te analyseren, kan onderzoekers uren tijd besparen wanneer gegevens batchgewijs worden verwerkt, maar het vereist enige initiële tijdsinvestering om de parameters aan te passen voor optimale resultaten. De belangrijkste factoren zijn de verwachte grootte (in μm2) van het actieve gebied en de duur van het signaal (minimale signaaltijd en maximale signaaltijd moeten worden gedefinieerd). Onderzoekers moeten eerst enkele voorbeeldfilms uit de T-serie onderzoeken om te bepalen welke parameters het beste bij hun gegevens passen. Ten slotte kunnen gegevens van slechte kwaliteit die op de microscoop zijn verkregen, de analyse van calcium en hemodynamiek sterk belemmeren(figuur 6). Daarom moet ervoor worden gezorgd dat de microscoopacquisitie-instellingen in het begin worden geoptimaliseerd. Met deze factoren in gedachten, dit protocol dat kan worden aangepast aan calcium beeldvorming of analyse van andere dynamische cellulaire signalen (bijv. Fluorescerend natrium, kalium, metaboliet of spanningsschommelingen) in andere weefsels of celtypen.
Er zijn verschillende beperkingen aan dit protocol. Ten eerste worden de gegevens verzameld onder anesthesie, wat de hersenactiviteit beïnvloedt en de bloedstroom kan beïnvloeden. Soortgelijke beeldvorming kan worden gedaan bij wakkere muizen die zijn getraind om hoofdfixatie te accepteren voor meer fysiologische resultaten. Bovendien is het belangrijk om te onthouden dat we 2-dimensionale beelden van een 3-dimensionale cel en bloedvat in vivoverzamelen . Daarom kunnen we slechts een factie van de calciumgebeurtenissen in deze cellen of de bloedstroom in een enkel deel van het bloedvat tegelijk vastleggen.
Een andere beperking om op te merken is dat calciumbeeldvorming met twee fotonen gevoelig is voor bewegingsartefacten, waarbij beweging in en uit het brandpuntsvlak kan worden aangezien voor calciumschommelingen. Dit protocol werd uitgevoerd onder anesthesie, wat de beweging van het dier beperkt; bewegingsartefacten kunnen echter worden geïntroduceerd door de ademhalingsfrequentie van de muis, hartslag, mogelijke zwelling van het weefsel en in het geval van ensheathing pericyten, vaatcontractie of vasomotion 4,6,18,19. Bewegingsartefacten kunnen worden beperkt door verschillende strategieën. De beeldverwerkingspakketten die in dit protocol worden gebruikt, bevatten een optionele bewegingscorrectiestap, die een 2D-convolutie-engine gebruikt om de beelden binnen de T-serie uit te lijnen op basis van de zichtbare vasculatuur13,17. Frames met significante veranderingen in het brandpuntsvlak worden door dit algoritme geïdentificeerd en kunnen worden uitgesloten van analyse. Bovendien is het mogelijk om statistische strategieën te gebruiken binnen de beeldvormingsverwerkingspakketten, zoals een Z-score bij het genereren van de fluorescentiesporen om de door beweging geïnduceerde calciumschommelingen te normaliseren20. De meest robuuste benadering om rekening te houden met bewegingsartefacten in beeldvorming met twee fotonen is het combineren van expressie van twee fluorescerende indicatoren binnen dezelfde cel, zoals een calciumindicator (bijv. GCaMP) en een fluorescerende reporter (bijv. mCherry) die calciumonafhankelijk is. Fluctuaties in de fluorescerende reporter kunnen vervolgens worden toegeschreven aan beweging en worden afgetrokken van het calciumindicatorsignaal om bewegingsartefacten te normaliseren.
Het doel van dit protocol is om een duidelijk inzicht te geven in hoe optimale calciumbeeldvorming en bloedstroomgegevens in vivo kunnen worden verzameld en om nieuwe methoden en analysetools te presenteren die onderzoekers kunnen implementeren om hun resultaten te verbeteren. Deze technieken kunnen worden toegepast om de rol van verschillende pericytenpopulaties in de controle van de bloedstroom of in verschillende hersenziektetoestanden te bestuderen. Deze beeldvormingsparameters kunnen ook worden gebruikt om calcium en bloedstroom in andere celtypen en orgaansystemen te bestuderen en vergelijkbare principes zijn van toepassing op andere dynamische beeldvormingstechnieken die mogelijk worden gemaakt door andere genetisch gecodeerde sensoren, naast calcium.
The authors have nothing to disclose.
J. Meza wordt ondersteund door fellowships van Mitacs en Research Manitoba. Financiering voor dit werk werd verstrekt door Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, start-up financiering van de Universiteit van Manitoba en Brain Canada via het Canada Brain Research Fund, met de financiële steun van Health Canada en de Azrieli Foundation. De standpunten die hierin worden uitgedrukt, vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de minister van Volksgezondheid of de regering van Canada.
Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |