Этот протокол представляет собой конструкцию и использование упрощенного аппарата плетизмографии всего тела для неинвазивного мониторинга прогрессирования бактериальных респираторных заболеваний.
Суррогатные животные модели заболеваний подпадают под действие 3R ответственного исследования. Существует частый пересмотр уточнений в моделях животных, чтобы гарантировать, что как благополучие животных, так и научные идеи продвигаются вперед с доступностью новых технологий. В данной статье демонстрируется использование упрощенной плетизмографии всего тела (sWBP) для неинвазивного изучения дыхательной недостаточности в модели летального респираторного мелиоидоза. sWBP обладает чувствительностью для обнаружения дыхания у мышей на протяжении всего течения заболевания, что позволяет измерять и потенциально использовать симптомы, связанные с умиранием (брадипноэ и гипопноэ), и потенциально использовать их для разработки гуманных критериев конечной точки.
Некоторые из преимуществ sWBP в контексте респираторных заболеваний заключаются в том, что мониторинг дыхания хозяина ближе всего подходит к любому физиологическому измерению при оценке дисфункции первичной инфицированной ткани, а именно легких. В дополнение к биологическому значению, использование sWBP является быстрым и неинвазивным, сводя к минимуму стресс у исследовательских животных. Данная работа демонстрирует использование собственного аппарата sWBP для мониторинга заболевания на протяжении всего течения дыхательной недостаточности в мышиной модели респираторного мелиоидоза.
Респираторные бактериальные возбудители часто связаны с воспалительной реакцией в легких, приводящей к патологии легких 1,2. В клинических условиях диагностика пневмонии обычно включает методы культивирования мокроты, анализ насыщения крови кислородом и рентген грудной клетки. Эти методы могут быть переведены для моделей инфекций мелких животных, но только анализ насыщения кислородом представляет собой быстрый анализ в режиме реального времени у мышей на тяжесть заболевания. Насыщение крови кислородом (SpO2) ранее исследовалось как метод отслеживания прогрессирования заболевания в исследованиях респираторных заболеваний; однако умирающие мыши имеют неожиданно высокие показания SpO2 как в модели Pseudomonas aeruginosa 3, которые не являются прогностическим или умирающим заболеванием, вероятно, потому, что мыши могут модулировать свою физиологическую активность. С этой целью диагностические уровни SpO2 до сих пор не были обнаружены для бактериальных респираторных заболеваний у мышей.
Поэтому в данной работе исследовалось использование других клинически значимых методов выявления влияния заболеваний легких на функцию легких в качестве быстрого физиологического измерения. Упрощенная плетизмография всего тела (sWBP) дает возможность исследовать частоту и глубину дыхания в качестве быстрого, неинвазивного биометрического анализа. Предыдущие исследования показали, как собрать аппарат WBP в лаборатории4; однако некоторые из компонентов, показанных в таких исследованиях, в настоящее время не являются коммерчески доступными. Кроме того, традиционная WBP требует сложного сбора и обработки данных на основе влажности и температуры 5,6. Следовательно, было решено разработать упрощенный аппарат WBP, который ежедневно калибруется в соответствии с комнатной температурой / влажностью и оценивает, влияет ли вклад температуры / влажности самого субъекта на измеряемый объем дыхания. Таким образом, был создан модифицированный аппарат sWBP, который использует имеющиеся в настоящее время материалы. Кроме того, было исследовано, может ли этот лабораторный аппарат обнаруживать изменения в дыхании, связанные с прогрессированием заболевания, во время модели летального респираторного мелиоидоза у мышей.
Аппарат sWBP, построенный для этой работы, использовал коммерчески доступное оборудование и программное обеспечение для обработки данных аналогового датчика давления в цифровое считывание. Датчик давления был установлен на герметичной стеклянной банке с разъемами переборки. Преимуществом стеклянной банки является структурная жесткость материала, которая будет противостоять изменениям внутреннего давления банки, влияя на измерения изменений объема во время мониторинга дыхания. Камера для отбора проб была спроектирована так, чтобы иметь два порта на двух плоских поверхностях квадратной банки, один для доступа к камере через разъем Luer для калибровки, а другой для размещения датчика давления. Выбранный датчик давления имеет высокочувствительный манометрический преобразователь давления с диапазоном для небольших изменений давления (диапазон 25 мбар).
Этот протокол демонстрируется с использованием мышиной модели респираторного мелиоидоза. Burkholderia pseudomallei (Bp) является бактериальным агентом мелиоидоза – заболевания, связанного с тропическими регионами мира7. Bp обнаруживается в окружающей среде, особенно во влажной среде стоячей воды и влажной почвы, из которой он обычно вызывает подкожные инфекции порезов / царапин восприимчивых хозяев. Тем не менее, АД также заразен при вдыхании и представляет собой потенциальную угрозу для использования в биотерроризме путем рассеивания аэрозолей. В то время как полностью вирулентный Bp требует обработки в лаборатории BSL-3, ранее был разработан акапсулярный мутантный штамм, который можно безопасно обрабатывать в BSL-2 и исключать из критерия выбора агента8. Кроме того, для изучения прогрессирования респираторных заболеваний адв. Мы использовали эту модель инфекции для характеристики изменения дыхания, которое происходит во время прогрессирования заболевания через умирающую конечную точку.
sWBP является привлекательным подходом для улучшения понимания респираторной инфекции на моделях мелких животных. Важно отметить, что это неинвазивный подход, и как таковой он не представляет значительного риска возникновения чрезмерного стресса у исследуемых животных во время инфекции. Действительно, процедура контроля дыхания субъекта представляет собой экспресс-тест, требующий нескольких минут и минимального обращения с субъектом. Научным преимуществом является понимание с высоким разрешением того, как микробные патогены влияют на функцию легких во время болезни. Этот подход принесет пользу фундаментальным исследованиям, облегчая понимание того, как патоген вызывает заболевание, а также обеспечивая трансляционную полезность для понимания того, как новое терапевтическое средство восстанавливает состояние респираторного здоровья субъекта исследования.
В этой рукописи представлены репрезентативные результаты для патогена B. pseudomallei, который вызывает раннюю летаргическую реакцию. Не все бактериальные инфекции легких присутствуют одинаково в моделях мышиной инфекции. Предыдущий опыт работы с другими моделями инфекции показал, что бактериальный патоген Klebsiella pneumoniae представляет собой бессимптомную инфекцию до того момента, когда мыши поддаются инфекции, также примерно на 3-й день после заражения11. Предполагается, что потребность хозяина во вдохновенном воздухе (т. е. минутный объем) может тесно связана со степенью летаргии, с которой проявляется данное заболевание. Будущие исследования потребуются для изучения того, как различные бактериальные патогены влияют на функцию легких во время респираторных заболеваний. Понятно, что различные патогены имеют уникальные подходы к уклонению от защиты хозяина, включая различия в ( 1) склонности к внутриклеточным или внеклеточным патогенам, (2) способности вызывать ранний / поздний гипотермический ответ и (3) использование различных репертуаров детерминант вирулентности 3,12,13. Поэтому вполне вероятно, что различные стратегии заболевания приведут к уникальному воздействию на функцию легких и дыхание во время инфекции.
Рекомендуемые настройки, описанные в этом протоколе, могут быть изменены для учета уникальных проблем, возникающих во время sWBP. Одной из распространенных проблем, возникающих во время сеанса записи sWBP, является движение субъекта в камере выборки. Как уже упоминалось, это движение изменяет базовую линию и может повлиять на точность измерений дыхания. Цифровой фильтр использовался для нормализации смещающейся базовой линии, что позволяло измерять жизнеспособное дыхание, несмотря на небольшие движения. Чрезмерное движение может вытолкнуть базовое измерение из диапазона обнуленного входа. Записи рекомендуются в диапазоне 1 мВ (настройка канала 1), что обеспечивает компромисс в наблюдении пиков плетизмографии, избегая потери данных за пределами диапазона. Для исключительно активных субъектов может потребоваться расширить диапазон записи >1 мВ, чтобы избежать постоянных сигналов вне диапазона.
Рекомендуемая процедура требует ежедневной калибровки (или на каждом сеансе) для учета колебаний влажности окружающей среды / температуры. Традиционная WBP использует сложные расчеты, которые учитывают температуру / влажность как окружающей среды, так ипредмета 5,6. Было продемонстрировано, что в настоящем аппарате sWBP воздействие температуры/влажности хозяина существенно не изменяет измеренный объем дыхания калибровочного источника. Поэтому такой подход в sWBP принципиально отличается от >50-летнего подхода Дрорбо и Фенна. Здесь sWBP напрямую связывает изменения давления с измеренным объемом дыхания без дальнейшей коррекции со стороны хозяина.
Важно противопоставить WBP на животных с клинической WBP. Типы биометрических данных, которые пытались собрать sWBP, – это объем и частота дыхания. Такие измерения собираются клинически с использованием простого спирометрического оборудования, в котором пациент прижимает монитор дыхания ко рту и нормально вдыхает в устройство, контролирующее воздушный поток. Подобная спирометрия у исследуемых животных требует сдержанности, тем самым способствуя стрессу и присущему нарушению дыхания. Поэтому простая спирометрия функциональна клинически, но не для исследовательских животных. WBP служит важной цели в клинике для сбора передовых данных, включая такие измерения, как остаточный объем легких. Такие данные могут содержаться только в контексте того, что субъект может следовать инструкциям о том, как он дышит, включая принудительное выдох (опорожнение легкого глубоким выдохом). На исследуемых животных нельзя полагаться, чтобы они следовали инструкциям исследователя по дыханию. Многие из передовых измерений, собранных клинически во время WBP, не могут быть воспроизведены на исследуемых животных. WBP у исследовательских животных принципиально отличается от клинической WBP. WBP животных стремится собирать простые данные вентиляции (частота дыхания и объем) несдержанным образом, чтобы избежать стресса животных и дыхательных возмущений. До сих пор использование WBP на исследовательских животных, по-видимому, повторяет методы, используемые в клинической WBP, включая сложные расчеты, основанные на температуре и влажности окружающей среды и субъекта, но без возможности сбора передовых данных от субъекта, который может следовать инструкциям о том, как выполнить принудительный экспирацию. Имея это в виду, было предпринято стремление продемонстрировать, будет ли упрощенной версии WBP достаточно для сбора соответствующей частоты и объема дыхания, относящихся к исследованиям респираторных заболеваний. Был использован сеанс калибровки, который компенсировал любые изменения температуры и влажности окружающей среды. Кроме того, с помощью искусственной мыши было продемонстрировано, что температура и влажность до измеренного объема дыхания не оказывают существенного влияния на точное измерение объема дыхания. Был сделан вывод о том, что sWBP имеет отличное применение для исследований на животных, без требования пользователя использовать громоздкую математическую обработку данных.
The authors have nothing to disclose.
Эти исследования были поддержаны грантом Национального института здравоохранения COBRE P20GM125504-01 Sub-Project 8246.
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |