该协议介绍了简化全身体积描记仪的构建和使用,以非侵入性地监测细菌性呼吸道疾病的进展。
疾病的替代动物模型受负责任研究的3R约束。人们经常重新审视对动物模型的改进,以确保动物福利和科学见解随着新技术的可用性而进步。本文演示了使用简化全身体积描记术(sWBP)在致命性呼吸类鼻疽模型中非侵入性研究呼吸衰竭。sWBP具有在整个疾病过程中检测小鼠呼吸的灵敏度,允许测量垂死的相关症状(呼吸过缓和低通气),并可能用于制定人道终点标准。
sWBP在呼吸系统疾病背景下的一些好处是,在评估原发性感染组织(即肺)的功能障碍方面,宿主呼吸监测是最接近任何生理测量的。除了生物学意义外,sWBP的使用是快速和非侵入性的,最大限度地减少研究动物的压力。这项工作证明了使用内部sWBP设备在呼吸类鼻疽小鼠模型中的整个呼吸衰竭过程中监测疾病。
呼吸道细菌病原体通常与肺部炎症反应有关,导致肺部病理学1,2。在临床情况下,肺炎的诊断通常包括痰培养技术、血氧饱和度分析和胸部 X 线检查。这些技术可以转化为小动物感染模型,但只有氧饱和度分析才能代表小鼠疾病严重程度的快速、实时分析。血氧饱和度(SpO2)先前在呼吸系统疾病研究中被研究为跟踪疾病进展的方法;然而,垂死小鼠在 铜绿假单胞 菌模型3中都具有出乎意料的高SpO2读数,这不是预测或垂死的疾病,可能是因为小鼠可以调节其生理活动。为此,到目前为止,在小鼠中没有发现细菌性呼吸道疾病的SpO2诊断水平。
因此,这项工作调查了使用其他临床相关方法来检测肺部疾病对肺功能的影响作为快速生理测量。简化的全身体积描记术(sWBP)提供了研究呼吸频率和深度的机会,作为一种快速、非侵入性的生物特征分析。以前的研究已经证明了如何在实验室中组装WBP设备4;然而,这些研究中显示的一些成分目前尚未商业化。此外,传统的WBP需要复杂的数据收集和基于湿度和温度的数据处理5,6。因此,决定开发一种简化的WBP设备,每天校准到室温/湿度,并评估受试者本身的温度/湿度贡献是否对测量的呼吸量有任何影响。因此,已经创建了一个改进的sWBP设备,该设备可以获取当前可用的材料。此外,已经研究了这种实验室来源的装置是否可以检测在小鼠致命呼吸类鼻疽模型期间与疾病进展相关的呼吸变化。
为这项工作构建的sWBP设备使用市售设备和软件将模拟压力传感器数据处理成数字读数。压力传感器安装在带有隔板连接器的密封玻璃罐上。玻璃罐的好处是材料的结构刚度,它将抵抗罐子内部压力的变化,影响呼吸监测期间体积变化的测量。取样室设计为在方形罐子的两个平面上有两个端口,一个通过鲁尔连接器进入腔室进行校准,另一个用于容纳压力传感器。所选压力传感器具有高度灵敏的表压传感器,其范围为压力的微小变化(25 mbar范围)。
使用呼吸道类鼻疽的小鼠模型演示该协议。 伯克霍尔德氏菌 (Bp)是类鼻疽的细菌病原体 – 一种与世界热带地区相关的疾病7。Bp存在于环境中,特别是在积水和潮湿土壤的潮湿环境中,它通常会导致易感宿主割伤/划伤的皮下感染。然而,Bp在吸入时也具有传染性,并且是通过气溶胶传播用于生物恐怖主义的潜在威胁。虽然完全毒力的 Bp 需要在 BSL-3 实验室进行处理,但之前设计了一种无肩突变菌株,可以在 BSL-2 中安全处理,并排除在选择药物标准8 之外。此外,已经开发了插管介导的呼吸道类鼻疽气管内(IMIT)感染模型,以研究Bp5,9的呼吸系统疾病进展。我们已经使用这种感染模型来表征疾病进展过程中通过垂死终点发生的呼吸变化。
sWBP是增强小动物模型中呼吸道感染理解的一种有吸引力的方法。重要的是,它是一种非侵入性方法,因此,在感染挑战期间,它不会对研究动物造成过度压力的重大风险。事实上,监测受试者呼吸的过程是一项快速测试,需要几分钟和最少的受试者处理。科学上的好处是高分辨率地了解微生物病原体在疾病期间如何影响肺功能。这种方法将为基础研究提供益处,促进对病原体如何引起疾病的理解,并提供一种转化效用,以了解一种新的治疗方法如何将研究对象恢复到呼吸系统健康状态。
在本手稿中,提供了病原体 B. pseudomallei 的代表性结果,该病原体会导致早期昏昏欲睡的反应。并非所有细菌性肺部感染在小鼠感染模型中都以相同的方式存在。以前使用其他感染模型的经验表明,细菌病原体肺炎克雷伯菌表现为无症状感染,直到小鼠屈服于感染,也是在感染后大约第3天11。据推测,宿主对吸入空气的需求(即分钟体积)可能与给定疾病出现的嗜睡程度密切相关。未来的研究将需要检查不同的细菌病原体如何影响呼吸系统疾病期间的肺功能。据了解,不同的病原体具有逃避宿主防御的独特方法,包括(1)细胞内或细胞外病原体的倾向,(2)引起早期/晚期低温反应的能力,以及(3)使用不同的毒力决定簇库3,12,13。因此,不同的疾病策略很可能会对感染期间的肺功能和呼吸产生独特的影响。
可以修改此协议中描述的推荐设置,以适应sWBP期间存在的独特挑战。在sWBP记录过程中遇到的常见问题之一是受试者在样品室内的移动。如前所述,这种运动会改变基线,并可能影响呼吸测量的准确性。使用数字滤波器对移动基线进行归一化,允许在微小移动的情况下进行可行的呼吸测量。过度移动可能会将基线测量值推出归零输入的范围。建议在1 mV范围(通道1设置)下进行记录,这样可以在仍然观察体积描记法的峰值的同时避免范围外的数据丢失。对于异常活跃的受试者,可能需要将记录范围延长>1 mV,以避免持续的超出范围信号。
推荐的程序要求每天校准(或在每个会话中)以适应环境湿度/温度波动。传统的WBP使用复杂的计算,将环境和受试者5,6的温度/湿度考虑在内。已经证明,在目前的sWBP设备中,主机温度/湿度的影响不会显着改变校准源的测量呼吸量。因此,sWBP中的这种方法与Drorbaugh和Fenn>50年前的方法根本不同。在这里,sWBP直接将压力变化与测量的呼吸量相关联,而无需主机进一步校正。
将研究动物WBP与临床WBP进行对比至关重要。sWBP尝试收集的生物特征数据类型是呼吸量和频率。这种测量值是使用简单的肺活量测定仪在临床上收集的,其中患者将呼吸监测器放在嘴边,并在监测气流的设备中正常呼吸。研究动物的类似肺活量测定需要克制,从而导致压力和呼吸的固有中断。因此,简单的肺活量测定法在临床上是有效的,但不适用于研究动物。WBP在临床中的基本目的是收集高级数据,包括残余肺容量等测量值。此类数据只能包含在受试者能够遵循有关其呼吸方式的说明的上下文中,包括强制呼气(通过深呼气排空肺部)。不能依靠研究动物遵循研究人员的呼吸指示。在WBP期间临床上收集的许多高级测量值无法在研究动物中重现。研究动物的WBP与临床WBP有根本的不同。动物WBP旨在以不受限制的方式收集简单的通气数据(呼吸频率和音量),以避免动物压力和呼吸扰动。到目前为止,在研究动物中使用WBP似乎复制了临床WBP中使用的技术,包括基于环境和受试者温度和湿度的复杂计算,但没有能力从受试者那里收集高级数据,可以遵循如何执行强制过期的说明。考虑到这一点,试图证明WBP的简化版本是否足以收集与呼吸系统疾病研究相关的呼吸频率和音量。采用校准会话,以补偿环境温度和湿度的任何变化。此外,用人造小鼠证明,将温度和湿度置于测量的呼吸量下对准确测量呼吸量没有显着影响。结论是,sWBP在研究动物研究中具有很好的应用,不需要用户对数据进行繁琐的数学处理。
The authors have nothing to disclose.
这些研究得到了美国国立卫生研究院COBRE拨款P20GM125504-01子项目8246的支持。
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |