Описан стандартный протокол для изучения противоопухолевой активности и связанной с ней токсичности IL-1α в сингенной мышиной модели HNSCC.
Цитокиновая терапия является многообещающей иммунотерапевтической стратегией, которая может вызывать надежные противоопухолевые иммунные реакции у больных раком. Провоспалительный цитокин интерлейкин-1 альфа (IL-1α) был оценен как противоопухолевое средство в нескольких доклинических и клинических исследованиях. Тем не менее, токсичность, ограничивающая дозу, включая гриппоподобные симптомы и гипотонию, ослабила энтузиазм в отношении этой терапевтической стратегии. Доставка IL-1α на основе полиангидридных наночастиц (NP) представляет собой эффективный подход в этом контексте, поскольку это может обеспечить медленное и контролируемое высвобождение IL-1α системно при одновременном снижении токсичных побочных эффектов. Здесь описан анализ противоопухолевой активности IL-1α-нагруженных полиангидридных НПз в модели сингенной мыши с плоскоклеточным раком головы и шеи (HNSCC). Мышиные ротоглоточные эпителиальные клетки, стабильно экспрессирующие HPV16 E6/E7 вместе с клетками hRAS и люциферазы (mEERL), вводили подкожно в правый фланг мышей C57BL/6J. Как только опухоли достигали 3-4 мм в любом направлении, 1,5% IL-1a – нагруженный 20:80 1,8-бис(p-карбоксифенокси)-3,6-диоксаоктан:1,6-бис(p-карбоксифенокси)гексан (CPTEG:CPH) препарат наночастиц (IL-1α-NP) вводили мышам внутрибрюшинно. Размер опухоли и масса тела непрерывно измерялись до тех пор, пока размер опухоли или потеря веса не достигли критериев эвтаназии. Образцы крови были взяты для оценки противоопухолевых иммунных реакций с помощью подчелюстной венипунктуры, а воспалительные цитокины были измерены с помощью мультиплексных анализов цитокинов. Опухолевые и паховые лимфатические узлы были резецированы и гомогенизированы в одноклеточную суспензию для анализа различных иммунных клеток с помощью многоцветной проточной цитометрии. Эти стандартные методы позволят исследователям изучить противоопухолевый иммунный ответ и потенциальный механизм иммуностимулирующих НП и других иммунотерапевтических агентов для лечения рака.
Одной из новых областей иммунотерапии рака является использование воспалительных цитокинов для активации иммунной системы пациентов против их опухолевых клеток. Некоторые провоспалительные цитокины (т.е. интерферон-альфа (IFNα), интерлейкин-2 (IL-2) и интерлейкин-1 (IL-1)) могут вызывать значительный противоопухолевый иммунитет, что вызвало интерес к изучению противоопухолевых свойств, а также безопасности препаратов на основе цитокинов. Интерлейкин-1 альфа (IL-1α), в частности, является провоспалительным цитокином, известным как главный цитокин воспаления1. С момента открытия этого цитокина в конце 1970-х годов он был исследован в качестве противоопухолевого агента, а также кроветворного препарата для лечения негативных последствий химиотерапии2. В конце 1980-х годов было проведено несколько доклинических и клинических исследований для определения противоопухолевых эффектов IL-1α 3,4,5,6. Эти исследования обнаружили многообещающую противоопухолевую активность рекомбинантного IL-1α (rIL-1α) в отношении меланомы, почечно-клеточной карциномы и карциномы яичников. Тем не менее, обычно наблюдались токсичности, включая лихорадку, тошноту, рвоту, гриппоподобные симптомы и наиболее серьезную гипотензию, ограничивающую дозу. К сожалению, эти токсичности, связанные с дозой, ослабили энтузиазм в отношении дальнейшего клинического использования rIL-1α.
Чтобы попытаться решить критическую проблему токсичности, опосредованной IL-1α, будут исследованы составы полиангидридных наночастиц (NP), которые допускают контролируемое высвобождение IL-1α кинетикой поверхностной эрозии. Эти NP-препараты предназначены для получения преимуществ противоопухолевых свойств IL-1α при одновременном снижении дозоограничивающих побочных эффектов7. Полиангидриды являются одобренными FDA полимерами, которые разлагаются в результате поверхностной эрозии, что приводит к почти нулевому высвобождению инкапсулированных агентов 8,9,10,11,12. Сообщалось, что амфифильные полиангидридные сополимеры, содержащие 1,8-бис-(p-карбоксифенокси)-3,6-диоксаоктан (CPTEG) и 1,6-бис-(p-карбоксифенокси)гексан (CPH), являются отличными системами доставки для различных полезных нагрузок в онкологических и иммунологических исследованиях 8,12. В следующем протоколе 20:80 CPTEG:CPH NPs, загруженные 1,5 мас.% rIL-1α (IL-1α-NPs), будут использоваться для изучения противоопухолевой активности и токсичности этого цитокина в мышиной модели HNSCC.
Общей целью следующих процедур является оценка противоопухолевой активности IL-1α-NPs на HNSCCs. Описанные процедуры, включая оценку роста и выживаемости опухоли, могут быть применены к любому иммуномодуляторному агенту, представляющему интерес. Эти процедуры должны выполняться на сингенной мышиной модели с интактной иммунной системой13 , чтобы максимизировать клиническую значимость. Токсичность IL-1α-NP также будет оцениваться путем измерения изменений в циркулирующих уровнях провоспалительных цитокинов и массе животных. Существует множество методов определения токсичности препарата in vivo ; однако наиболее широко используемые методы включают измерение сывороточных ферментов для токсичности органов и гистологических изменений в этих органах. Однако для выполнения гистологического анализа животное нужно принести в жертву, что повлияет на кривые выживаемости эксперимента. Поэтому этот протокол будет включать протокол сбора крови у живых мышей для измерения цитокинов в образцах сыворотки. Собранная сыворотка может быть использована для измерения любых желаемых сывороточных аналитов на токсичность для органов. Многоцветная проточная цитометрия будет использоваться для понимания изменений в популяции иммунных клеток в микроокружении опухоли и миграции иммунных клеток в лимфатический узел. Другие способы могут быть использованы для идентификации иммунных клеток, включая иммуногистохимию и/или иммунофлуоресценцию сохраненных участков14. Тем не менее, эти методы могут быть трудоемкими и утомительными для выполнения на большом количестве животных. В целом, следующие методы позволят исследователям изучить противоопухолевый иммунный ответ и потенциальные механизмы иммуностимулирующих агентов для лечения рака.
Этот протокол позволит любому исследователю изучить противоопухолевую активность и некоторые из основных механизмов иммуномодулирующих препаратов в модельной системе опухоли in vivo . Здесь была использована модель сингенной подкожной опухоли, которая имеет несколько преимущест?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана наградой Merit Review Award #I01BX004829 из Соединенных Штатов (США). Департамент по делам ветеранов, Служба биомедицинских лабораторных исследований и разработок и поддерживается программой mezhir Award через Комплексный онкологический центр Holden в Университете Айовы.
Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
Portable Balances | Ohaus | ||
Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |