يوصف بروتوكول قياسي لدراسة النشاط المضاد للأورام والسمية المرتبطة ب IL-1α في نموذج فأر متزامن من HNSCC.
العلاج بالسيتوكين هو استراتيجية علاجية مناعية واعدة يمكن أن تنتج استجابات مناعية قوية مضادة للأورام لدى مرضى السرطان. تم تقييم السيتوكين الالتهابي إنترلوكين -1 ألفا (IL-1α) كعامل مضاد للسرطان في العديد من الدراسات قبل السريرية والسريرية. ومع ذلك ، فإن السمية التي تحد من الجرعة ، بما في ذلك الأعراض الشبيهة بالإنفلونزا وانخفاض ضغط الدم ، قد أضعفت الحماس لهذه الاستراتيجية العلاجية. سيمثل تسليم IL-1α القائم على الجسيمات النانوية متعددة الهيدريد (NP) نهجا فعالا في هذا السياق لأن هذا قد يسمح بإطلاق بطيء وخاضع للرقابة ل IL-1α بشكل منهجي مع تقليل الآثار الجانبية السامة. هنا يتم وصف تحليل للنشاط المضاد للأورام ل NPs polyanhydride المحملة ب IL-1α في نموذج الفأر الجيني لسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC). تم حقن الخلايا الظهارية الفموية البلعومية التي تعبر بثبات عن فيروس الورم الحليمي البشري 16 E6 / E7 مع خلايا hRAS و luciferase (mEERL) تحت الجلد في الجناح الأيمن للفئران C57BL / 6J. بمجرد وصول الأورام إلى 3-4 مم في أي اتجاه ، تم إعطاء تركيبة الجسيمات النانوية IL-1a 1.5٪ المحملة 20:80 1،8-مكرر (p-carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane: 1،6-bis (p-carboxyphenoxy) hexane (CPTEG: CPH) تركيبة الجسيمات النانوية (IL-1α-NP) للفئران داخل الصفاق. تم قياس حجم الورم ووزن الجسم بشكل مستمر حتى وصل حجم الورم أو فقدان الوزن إلى معايير القتل الرحيم. تم أخذ عينات الدم لتقييم الاستجابات المناعية المضادة للأورام عن طريق بزل الوريد تحت الفك السفلي ، وتم قياس السيتوكينات الالتهابية من خلال مقايسات السيتوكينات المتعددة. تم استئصال الورم والغدد الليمفاوية الأربية وتجانسها في تعليق أحادي الخلية لتحليل الخلايا المناعية المختلفة من خلال قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. ستسمح هذه الطرق القياسية للباحثين بدراسة الاستجابة المناعية المضادة للأورام والآلية المحتملة ل NPs المناعية وعوامل العلاج المناعي الأخرى لعلاج السرطان.
أحد المجالات الناشئة في العلاج المناعي للسرطان هو استخدام السيتوكينات الالتهابية لتنشيط الجهاز المناعي للمرضى ضد الخلايا السرطانية. يمكن للعديد من السيتوكينات المسببة للالتهابات (أي إنترفيرون ألفا (IFNα) وإنترلوكين -2 (IL-2) وإنترلوكين -1 (IL-1)) تكوين مناعة كبيرة مضادة للأورام ، مما أثار الاهتمام باستكشاف الخصائص المضادة للأورام بالإضافة إلى سلامة الأدوية القائمة على السيتوكين. إنترلوكين -1 ألفا (IL-1α) على وجه الخصوص ، هو السيتوكين الالتهابي المعروف باسم السيتوكين الرئيسي للالتهاب1. منذ اكتشاف هذا السيتوكين في أواخر 1970s ، تم التحقيق فيه كعامل مضاد للسرطان وكذلك دواء مكون للدم لعلاج الآثار السلبية للعلاج الكيميائي2. خلال أواخر 1980s ، أجريت العديد من الدراسات قبل السريرية والسريرية لتحديد الآثار المضادة للسرطان من IL-1α3،4،5،6. وجدت هذه الدراسات نشاطا واعدا مضادا للأورام ل IL-1α المؤتلف (rIL-1α) ضد سرطان الجلد وسرطان الخلايا الكلوية وسرطان المبيض. ومع ذلك ، لوحظت السميات ، بما في ذلك الحمى والغثيان والقيء والأعراض الشبيهة بالإنفلونزا ، وانخفاض ضغط الدم الأكثر حدة الذي يحد من الجرعة. لسوء الحظ ، أدت هذه السمية المرتبطة بالجرعة إلى تثبيط الحماس لمزيد من الاستخدام السريري ل rIL-1α.
لمحاولة معالجة القضية الحرجة المتمثلة في السمية بوساطة IL-1α ، سيتم التحقيق في تركيبات الجسيمات النانوية متعددة الأنهيدريد (NP) التي تسمح بالإطلاق الخاضع للرقابة ل IL-1α بواسطة حركية تآكل السطح. تهدف تركيبات NP هذه إلى جني فوائد الخصائص المضادة للأورام ل IL-1α مع تقليل الآثار الجانبية التي تحد من الجرعة7. Polyanhydrides هي بوليمرات معتمدة من إدارة الغذاء والدواء تتحلل من خلال تآكل السطح مما يؤدي إلى إطلاق ما يقرب من الصفر من العوامل المغلفة8،9،10،11،12. تم الإبلاغ عن أن البوليمرات المشتركة متعددة الهيدريد البرمائية التي تحتوي على 1،8-مكرر – (p-carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane (CPTEG) و 1،6-مكرر (p-carboxyphenoxy) الهكسان (CPH) ، هي أنظمة توصيل ممتازة لمختلف الحمولات في علم الأورام والبحوث القائمة على المناعة 8،12. في البروتوكول التالي 20:80 CPTEG: CPH NPs المحملة ب 1.5٪ بالوزن٪ rIL-1α (IL-1α-NPs) سيتم استخدامها لدراسة النشاط المضاد للأورام وسمية هذا السيتوكين في نموذج فأر من HNSCC.
الهدف العام من الإجراءات التالية هو تقييم النشاط المضاد للأورام ل IL-1α-NPs على HNSCCs. يمكن تطبيق الإجراءات الموصوفة ، بما في ذلك تقييم نمو الورم والبقاء على قيد الحياة ، على أي عامل تعديل مناعي ذي أهمية. يجب تنفيذ هذه الإجراءات في نموذج فأر syngeneic مع نظام مناعي سليم13 لتحقيق أقصى قدر من الأهمية السريرية. كما سيتم تقييم سمية IL-1α-NP عن طريق قياس التغيرات في مستويات السيتوكينات المسببة للالتهابات ووزن الحيوان. هناك العديد من الطرق لتحديد سمية الدواء في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما تتضمن قياس إنزيمات المصل لسمية الأعضاء والتغيرات النسيجية في تلك الأعضاء. ومع ذلك ، لإجراء التحليلات النسيجية ، يجب التضحية بالحيوان ، مما سيؤثر على منحنيات البقاء على قيد الحياة في التجربة. لذلك ، سيتضمن هذا البروتوكول بروتوكولا لجمع الدم من الفئران الحية لقياس السيتوكينات في عينات المصل. يمكن استخدام المصل الذي تم جمعه لقياس أي تحليلات مصل مرغوبة لسمية الأعضاء. سيتم استخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان لفهم التغيرات في عدد الخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم وهجرة الخلايا المناعية إلى العقدة الليمفاوية. يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد الخلايا المناعية ، بما في ذلك الكيمياء المناعية و / أو التألق المناعي للأقسامالمحفوظة 14. ومع ذلك ، يمكن أن تستغرق هذه التقنيات وقتا طويلا ومملة لأدائها على عدد كبير من الحيوانات. بشكل عام ، ستسمح الطرق التالية للباحثين بدراسة الاستجابة المناعية المضادة للأورام والآليات المحتملة لعوامل التحفيز المناعي لعلاج السرطان.
سيسمح هذا البروتوكول لأي باحث بدراسة النشاط المضاد للأورام وبعض الآليات الأساسية للأدوية المعدلة للمناعة في نظام نموذج فأر الورم في الجسم الحي . هنا ، تم استخدام نموذج الورم تحت الجلد الجيني ، والذي له العديد من المزايا على نماذج تقويم العظام ، بما في ذلك بروتوكوله المباشر تقنيا ، وا?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل #I01BX004829 جائزة مراجعة الاستحقاق من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) قسم شؤون المحاربين القدامى ، خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية وبدعم من برنامج جائزة Mezhir من خلال مركز هولدن الشامل للسرطان في جامعة أيوا.
Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
Portable Balances | Ohaus | ||
Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |