Este es un método para aislar las células linfoides uterinas de ratones preñados y no preñados. Este método se puede utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, como fenotipado FACS, clasificación celular, ensayos funcionales, ARN-seq y proteómica. El protocolo aquí demuestra cómo fenotipar el grupo 1 de las células linfoides innatas uterinas mediante citometría de flujo.
Aquí se describe un método simple para aislar y fenotipar células linfoides innatas uterinas del grupo 1 de ratón (g1 uILCs) del útero embarazada individual mediante citometría de flujo. El protocolo describe cómo configurar el apareamiento del tiempo para obtener múltiples presas síncronas, la digestión mecánica y enzimática del útero embarazada, la tinción de suspensiones unicelulares y una estrategia FACS para fenotipar y discriminar a los uILC g1. Aunque este método inevitablemente pierde la información espacial de la distribución celular dentro del tejido, el protocolo se ha aplicado con éxito para determinar la heterogeneidad de uILC, su respuesta a los factores maternos y fetales que afectan el embarazo, su perfil de expresión génica y sus funciones.
Aquí se describe un método simple para obtener un alto rendimiento de linfocitos innatos uterinos del útero embarazada individual. Este método preserva la expresión de la superficie proteica y la funcionalidad de los linfocitos innatos uterinos y es adecuado para aplicaciones posteriores como fenotipado FACS, RNAseq, proteómica o ensayos funcionales. Aquí, la atención se centra en el fenotipado de los uILCs del grupo 1 por citometría de flujo.
El útero está compuesto por tres capas: el endometrio, el miometrio y el perimetrio (Figura 1). El endometrio es la mucosa, que recubre la luz del útero. La progesterona, producida por el cuerpo lúteo, convierte el endometrio en decidua. El miometrio está compuesto por dos capas de músculo liso que forman la pared uterina. El perimetrio es la serosa que envuelve el útero y lo conecta con el peritoneo a través del ligamento ancho llamado mesometrio. En una sección transversal del útero, la parte opuesta a la luz se llama lado mesometrial, mientras que la parte cercana a la luz se llama lado antimesometrial. Una variedad de leucocitos maternos pueblan el endometrio y la decidua, incluyendo varios tipos de células, donde las células inmunes innatas representan la gran mayoría de las células. Las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células dendríticas (DC), así como los linfocitos T CD4+ y CD8+, las células T reguladoras (Tregs) y las células B raras, pueden desempeñar un papel importante en la regulación del entorno uterino a lo largo del embarazo1,2. Las ILC en el útero se encuentran no solo en la mucosa, sino también en el miometrio en ratones. Incluyendo los tres grupos de ILC, el útero es de hecho el órgano más densamente poblado por ILC del grupo 1. Con la transformación estructural de los tejidos uterinos a lo largo de la gestación, el número y la proporción de leucocitos uterinos también cambian (ver Figura 2A para un ejemplo de variaciones en el porcentaje de subconjuntos uILC del grupo 1)3,4.
Cuando se hace referencia a los ratones en este documento, se refiere a la cepa C57BL / 6 de ratones de laboratorio consanguíneos. Los ratones de raza avanzada (por ejemplo, ratones NMRI) se utilizan a menudo en la investigación reproductiva debido a su alta tasa reproductiva. Sin embargo, el uso de cepas consanguíneas es necesario para generar resultados consistentes, y el fondo genético favorito del inmunólogo es C57BL / 6, también conocido como B6.
Aproximadamente el 30% de los leucocitos uterinos en las madres B6 a mitad de la gestación son células g1 uILCs, que se definen por citometría de flujo como células CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ viables (Figura 2B): células NK proangiogénicas residentes en tejido (trNK), IFN-g productoras de NK convencional (cNK) y uILC14,5. El porcentaje de células uNK es aún mayor en humanos, alcanzando alrededor del 70% en el primer trimestre6. Hay más similitudes que diferencias entre uNK humano y ratón y uILC7,8. Aunque es importante tener en cuenta las diferencias, es útil integrar la información disponible sobre las dos especies. Cuando se combina la información obtenida de la investigación de la uILC en humanos y roedores de laboratorio, queda claro que las células NK ayudan en cambios homeostáticos esenciales para la biología del útero, incluyendo el mantenimiento de la integridad arterial9 y la remodelación de la arteria espiral10, así como la invasión de trofoblastos11,12. También desempeñan funciones específicas en la defensa contra patógenos13,14. En ratones y ratas, además de llenar la decidua alrededor del sitio de implantación, las células NK se acumulan entre las dos capas musculares del miometrio de las presas en una estructura transitoria conocida como el Agregado Linfoide Mesometrial del embarazo (MLAp)15 (Figura 1B), también conocida en el pasado como la glándula auricular, cuya función aún no se ha descubierto.
Aquí se describe un protocolo detallado del método utilizado en el laboratorio para aislar linfocitos del útero de ratones preñados utilizando una combinación de desagregación mecánica y digestión enzimática. Como todo el útero se utiliza en el método, los linfocitos aislados del útero durante la gestación son una mezcla de células deciduales y miometriales. Es posible una disección adicional de la decidua de la pared uterina y su MLAp, y se ha descrito antes16. El método descrito aquí fue desarrollado para obtener linfocitos uterinos preservando al mismo tiempo la expresión de la superficie de la proteína, la funcionalidad celular y la viabilidad. El resultado es una suspensión de una sola célula con un mínimo de residuos celulares y un rendimiento que generalmente oscila entre 1 y 5 millones de células a mediados de la gestación (10,5 días) para un útero embarazada. Las aplicaciones de este método abarcan el fenotipado por citometría de flujo, la clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos posteriores, estudios funcionales como la producción intracelular de citoquinas, la degranulación, ELISPOT o ensayos citotóxicos. El protocolo presentado aquí se centra en la identificación de ILC del grupo 1, pero se puede adaptar para otros tipos de células, como otras ILC, células T, células B, DC o macrófagos con modificaciones menores del panel de anticuerpos utilizado para el análisis DE FACS. El protocolo también se puede utilizar para aislar células de otros tejidos y para úteros no embarazadas agrupados.
El método contiene varios pasos críticos que se analizan a continuación. El primer paso crítico es obtener embarazos sincrónicos múltiples a medida que la frecuencia relativa de las poblaciones de leucocitos cambia a lo largo del embarazo. Tener múltiples presas en el mismo día gestacional permite repeticiones biológicas en los mismos experimentos o agrupar linfocitos de presas individuales para obtener un mayor número requerido para aplicaciones aguas abajo. El apareamiento cronometrado permite al investigador identificar la concepción dentro de un período de 24 horas. Aunque los ratones viven alrededor de 2,5 años, estarán en edad reproductiva de 4-7 semanas hasta los 6-8 meses de edad. Como los ratones más jóvenes generalmente producen cachorros más pequeños, los ratones hembra generalmente no se aparean hasta que tienen entre 6 y 8 semanas, y los ratones machos hasta que tienen entre 8 y 10 semanas. Dado que el estro dura aproximadamente 15 h en ratones y ocurre cada 4-5 días, la tasa de apareamiento típica (revelada por un tapón vaginal, ver Figura 4) es de alrededor del 25%. Por lo tanto, es importante utilizar ratones en celo y planificar números suficientes para obtener el número requerido de presas para un experimento determinado. La fase del ciclo del estro se puede determinar mediante citología de frotis vaginal22. La velocidad de tapón se puede mejorar descansando los machos 48 h antes del apareamiento y aprovechando el efecto Whitten18. Alternativamente, se puede administrar suero de yegua embarazada, que imita el efecto de la hormona endógena estimulante del folículo, induciendo la maduración de los ovocitos y, 42-50 h más tarde, gonadotropina coriónica humana, que imita el efecto de la hormona luteinizante endógena, induciendo la ovulación. Este tratamiento hormonal evita el requerimiento de estro y hace que prácticamente todas las hembras tratadas sean receptivas.
Un segundo paso crítico es garantizar la calidad de la tinción FACS. Los anticuerpos utilizados en la citometría de flujo siempre deben ser titulados y utilizados a la concentración óptima, y es necesario comprobar que la digestión enzimática no escinde epítopos antigénicos cruciales. Para evaluar si una enzima escinde un epítopo, se podrían teñir dos fracciones de la misma muestra en paralelo, una sometida a digestión enzimática y la otra mecánica. Del mismo modo, el uso de controles adecuados y tinciones individuales es crucial para obtener datos fiables. Para eventos raros, las cuentas se pueden usar para generar muestras de tinción única. Se recomienda no usar perlas para establecer voltajes, sino más bien una población de células que contengan linfocitos y otros leucocitos, como los esplenocitos. Si se usan perlas, es necesario valorar los anticuerpos para la tinción de perlas, por lo que la intensidad de fluorescencia de las perlas teñidas será comparable a la intensidad de fluorescencia de las células. En caso de dificultad para separar las células positivas de las negativas para un marcador en particular, también se puede utilizar un control FMO para facilitar la apertura de un marcador específico. En el caso de los marcadores intracelulares, se debe utilizar un control de isotipo, ya que la tinción intracelular podría dar lugar a anticuerpos residuales no unidos, que aún pueden estar presentes dentro de las células después de los pasos de lavado y, por lo tanto, aumentar la señal de fondo. Se recomienda ejecutar las muestras dentro de las 24 h posteriores a la fijación de las células para obtener los mejores resultados en fenotipado mediante análisis FACS, ya que la autofluorescencia aumenta significativamente con el tiempo y la intensidad de fluorescencia de algunos anticuerpos puede disminuir con el tiempo.
Otro factor crucial a considerar es la aplicación posterior de la suspensión unicelular obtenida con el protocolo. Para los ensayos funcionales, es esencial trabajar en condiciones estériles. Del mismo modo, para estudios ómicos posteriores, es importante trabajar en estériles y libres de RNasa, DNasa y proteasa.
El protocolo presentado aquí se centra en el fenotipado de ILC del grupo 1, pero se puede adaptar para fenotipar otros tipos de células modificando el panel de anticuerpos. Se recomienda que todos los anticuerpos se prueben contra la suspensión celular digerida y no digerida para detectar la pérdida/alteración de los epítopos superficiales mediante el tratamiento enzimático. Del mismo modo, se pueden usar diferentes enzimas para digerir el tejido y aumentar el rendimiento celular, pero su efecto sobre epítopos antigénicos cruciales debe estudiarse cuidadosamente. Mientras que NKp46 es un buen marcador para las células NK esplénicas y funciona en todas las cepas de ratones de laboratorio, la expresión de NKp46 en células uNK en ratones C57BL/6 es considerablemente menor que en células NK del bazo. Es mejor manchar tanto para NK1.1 como para NKp46 simultáneamente. Si se van a comparar varios órganos directamente, se recomienda tratar todas las muestras por igual, incluso si la digestión enzimática no es necesaria para tejidos como el bazo o la médula ósea. Aunque el método presentado aquí es aplicable al útero no embarazada, el aislamiento del anillo de linfocitos por un gradiente de Percoll de dos fases será un desafío, y el rendimiento de las células aisladas puede ser demasiado bajo para un análisis FACS confiable y, por lo tanto, requerirá agrupar células aisladas del útero de ratones individuales no preñados23.
Existen limitaciones al protocolo a considerar para la interpretación de los datos. Como es el caso de todos los tejidos, los linfocitos circulantes provenientes de la sangre se aislarán junto con las células residentes en el tejido. Si la exclusión de los linfocitos circulantes es esencial para la interpretación de los datos, se puede realizar una tinción intravital para etiquetar las células circulantes. Además, una segunda limitación del protocolo es que algunas células se perderán, ya que no todas las células se pueden extraer del tejido. Los problemas más comunes y su solución de problemas se presentan en la Tabla 2.
Históricamente, el estudio de las células en los tejidos se ha basado en el examen histológico de las secciones de tejido. La excelente reseña de Sandra Peel24 resume el trabajo realizado a lo largo de más de 100 años hasta finales de los años 80. Las descripciones de células más tarde conocidas como células uNK aparecen en manuscritos publicados más de medio siglo antes de que se descubrieran los linfocitos. Por lo tanto, antes del descubrimiento de las células NK en 1975, y las células uNK se han indicado como células de glucógeno materno o células granuladas de la glándula auricular. Anne Croy ha hecho importantes contribuciones en el campo25 y amablemente enseñó al equipo la disección que había optimizado3, y que se utiliza actualmente. Aunque es fundamental para describir la morfología y la ubicación tisular de las células uNK, el examen histológico clásico se limita a la detección de solo unos pocos marcadores en las células de interés. En 2008 se describió un método basado en citometría de flujo para detectar simultáneamente múltiples marcadores en linfocitos uterinos26. Este es esencialmente el método que se ha descrito en este artículo. Tecnologías más recientes como la transcriptómica espacial y la obtención de imágenes por citometría de masas combinan el poder de la histología y la citometría de flujo, permitiendo tanto la detección simultánea de múltiples genes o proteínas, respectivamente, como la preservación de la arquitectura tisular normal.
Las aplicaciones del método descrito aquí son múltiples e incluyen fenotipado FACS, ensayo funcional (como ELISPOT, degranulación o ensayos citotóxicos), clasificación celular y transcriptómica o proteómica posterior. Otras aplicaciones que podrían desarrollarse en base a este método incluyen el cultivo y la expansión de células NK deciduales después de la clasificación o enriquecimiento celular por agotamiento negativo. Actualmente, no existe un protocolo para cultivar y expandir las células uNK de ratón y preservar su viabilidad y funcionalidad durante un período prolongado, de manera similar a las células NK humanas que se pueden cultivar y expandir durante 7-14 días mediante la adición de IL-2 o una combinación de IL-12 e IL-15. La optimización de dicho método para células uNK de ratón proporcionaría más flexibilidad al realizar ensayos funcionales y permitiría probar múltiples condiciones con un número de células más alto. Por otro lado, se sabe que las condiciones de cultivo modifican el fenotipo único de los linfocitos y potencialmente su función también.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros anteriores y actuales del equipo que han ayudado a desarrollar este método, incluidos Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic y Anita Qualls. Esta investigación fue financiada por el Fideicomiso Wellcome [Número de subvención 200841/Z/16/Z] y el Consejo de Investigación Médica (MR/P001092/1). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
CD19 antibody | BD | 562701 | |
CD3 antibody | BD | 562600 | |
CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
CD49a antibody | BD | 740262 | |
DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |