Dit protocol presenteert de diavoorbereiding en geautomatiseerde scoring van de γ-H2AX foci assay op perifere bloedlymfocyten. Om de methode en gevoeligheid van de test te illustreren, werden geïsoleerde lymfocyten in vitrobestraald . Deze geautomatiseerde methode van DNA DSB-detectie is nuttig voor snelle en high-throughput biologische dosimetrietoepassingen.
Ioniserende straling is een krachtige inductor van DNA-schade en een goed gedocumenteerd carcinogeen. Biologische dosimetrie omvat de detectie van biologische effecten veroorzaakt door blootstelling aan ioniserende straling om een individuele dosisbeoordeling uit te voeren. Dit is relevant in het kader van stralingsnoodsituaties, waar gezondheidsbeoordelingen en planning van klinische behandeling voor blootgestelde slachtoffers van cruciaal belang zijn. Aangezien DNA double streng breaks (DSB) worden beschouwd als de meest dodelijke vorm van door straling geïnduceerde DNA-schade, presenteert dit protocol een methode om DNA DSB in bloedmonsters te detecteren. De methodologie is gebaseerd op de detectie van een fluorescerend gelabeld gefosforyleerd DNA-reparatie-eiwit, namelijk γ-H2AX. Het gebruik van een geautomatiseerd microscopieplatform om het aantal γ-H2AX-foci per cel te scoren, maakt een gestandaardiseerde analyse mogelijk met een significante afname van de doorlooptijd. Daarom heeft de γ-H2AX-test het potentieel om een van de snelste en gevoelige testen voor biologische dosimetrie te zijn. In dit protocol zullen volbloedmonsters van gezonde volwassen vrijwilligers in vitro worden verwerkt en bestraald om het gebruik van de geautomatiseerde en gevoelige γ-H2AX foci assay voor biodosimetrietoepassingen te illustreren. Er wordt gebruik gemaakt van een geautomatiseerd diascansysteem en analyseplatform met een geïntegreerde fluorescentiemicroscoop, die het mogelijk maakt om DNA DSB snel en automatisch te scoren met een verminderde mate van bias.
Sinds de ontdekking is ioniserende straling (IR) een onmisbaar hulpmiddel geworden in de huidige medische en industriële praktijken, evenals in agrarische en militaire toepassingen. Het brede gebruik van IR verhoogt echter ook het risico op overbelichting van straling voor zowel professionele stralingswerkers als leden van het publiek. IR is een bekende fysische kankerverwekkende stof die op een directe of indirecte manier DNA-schade kan veroorzaken, wat leidt tot aanzienlijke gezondheidsrisico’s 1,2. Daarom is het belangrijk om een dosisbeoordeling uit te voeren, omdat de mate van blootstelling een belangrijke eerste stap vormt in het beheer van het stralingsongeval 1.
In het geval van grootschalige nucleaire of radiologische noodsituaties kan het aantal dosisbeoordelingen dat moet worden uitgevoerd variëren van enkele tot duizenden mensen, afhankelijk van de grootte van het ongeval3. In deze scenario’s kan fysieke dosimetrie ook dubbelzinnig zijn (bijvoorbeeld als de dosimeter niet goed wordt gedragen) of niet beschikbaar zijn, wanneer leden van het publiek betrokken zijn. Hoewel klinische symptomen kunnen worden gebruikt voor triage, zijn ze niet noodzakelijkerwijs stralingsspecifiek en kunnen ze resulteren in een valse diagnose. Daarom is het raadzaam om biologische dosimetrie te gebruiken naast fysieke dosimetrie en klinische beoordelingen. Deze methode maakt de analyse van door straling geïnduceerde veranderingen op cellulair niveau mogelijk en maakt de ondubbelzinnige identificatie mogelijk van blootgestelde personen die medische behandeling nodig hebben4. De arts kan deze biologische dosisbeoordeling vervolgens gebruiken als aanvulling op fysieke dosisreconstructies en andere klinische diagnoses, om de juiste medische zorg voor te schrijven5. De behoefte aan biologische dosimetrie zal vooral hoog zijn voor triage en medisch beheer van slachtoffers wanneer het blootstellingsscenario niet goed bekend is en wanneer de slachtoffers lid zijn van het publiek. Het belangrijkste doel van triage is om “bezorgde goed” personen, die prodromale symptomen kunnen hebben maar die geen hoge dosis hebben gekregen, effectief te onderscheiden van blootgestelde personen die onmiddellijke medische hulp en gespecialiseerde zorg nodig hebben. Het drempelniveau van stralingsdosis dat stralingsziekte kan veroorzaken is ongeveer 0,75 – 1,00 Gy. Vervolgens lopen die personen die > 2 Gy blootstelling krijgen een hoger risico op acuut stralingssyndroom en moeten ze een snelle medische behandelingkrijgen 6,7. Tijdige en nauwkeurige biologische dosisschattingen voor slachtoffers die gevangen zitten in het kruisvuur van dergelijke rampen zijn van cruciaal belang. Bovendien kan het ook minimaal blootgestelde slachtoffers troosten en geruststellen8.
Stralingsbeschermingsautoriteiten gebruiken verschillende biodosimetriemarkers, die voornamelijk gebaseerd zijn op de detectie van cytogenetische schade, zoals dicentrische chromosomen of micronuclei, in gekweekte menselijke lymfocyten9. De detectie van cytogenetische schade kan ook worden uitgevoerd door de fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) translocatie assay10. Het grote nadeel van de conventionele cytogenetische methoden is echter de lange doorlooptijd om de resultaten in een noodsituatie te verkrijgen8.
Een van de vroegste stappen in het DNA DSB-herkenningsproces is de fosforylering van de histonvariant H2AX, wat leidt tot de vorming van γ-H2AX en de daaropvolgende rekrutering van reparatiefactoren. In het afgelopen decennium heeft de detectie van door straling geïnduceerde γ-H2AX-foci in perifere bloedlymfocyten met behulp van immunofluorescentiemicroscopie steeds meer aandacht gekregen als een betrouwbaar biologisch dosimetrie-instrument11,12,13,14,15. Afhankelijk van de stralingskwaliteit en het celtype wordt de maximale opbrengst van γ-H2AX-foci gedetecteerd binnen 0,5 – 1 uur na bestraling16,17. Er wordt verwacht dat er een nauwe correlatie is tussen het aantal DNA DSB en γ-H2AX-foci, evenals tussen het verdwijnen van foci en DSB-reparatie. Laserschaarexperimenten met een gepulseerd lasermicroeam hebben aangetoond dat γ-H2AX-foci lokaliseren naar de plaatsen van DNA DSB18. Hoewel het een onderwerp van actief debat blijft, suggereerde een van de vroegste studies met 125I een één-op-één correlatie tussen het berekende aantal desintegraties per cel (representabel voor het aantal door straling geïnduceerde DNA DSB) en het aantal γ-H2AX-foci dat werd gescoord19,20.
In het afgelopen decennium heeft de Europese Unie de multibiodose-projecten (multidisciplinaire biodososimetrische instrumenten om radiologische slachtoffers op grote schaal te beheren) en RENEB-projecten (Realizing the European Network of Biodosimetry) gefinancierd om een duurzaam netwerk in biologische en retrospectieve dosimetrie te creëren21,22. Dit project omvatte verschillende laboratoria in heel Europa om de noodresponscapaciteiten in geval van stralingsgevaar te evalueren.14,21,22. De γ-H2AX foci assay heeft een aantal aanzienlijke voordelen, zoals een snelle verwerkingstijd, het potentieel voor batchverwerking waardoor een hoge doorvoer mogelijk is, evenals de hoge gevoeligheid bij gebruik binnen een paar uur na blootstelling13,23,24. De hoge gevoeligheid van de test in het lage dosisbereik resulteerde in een aantal studies waarbij de γ-H2AX foci assay werd gebruikt als indicator van het effect van medische blootstelling aan straling, zowel in radiotherapie als in diagnostische beeldvormingstoepassingen25,26,27,28,29,30. Deze kenmerken maken de γ-H2AX foci assay een zeer concurrerend alternatief voor andere methoden voor vroege triage bij grote nucleaire ongevallen om de kritisch blootgestelde van laagrisico personen te scheiden. Verschillende optimalisatie-experimenten hebben aangetoond dat het mogelijk is om de γ-H2AX foci assay uit te voeren met kleine hoeveelheden bloed, zoals de studie van Moquet et al. die meldden dat het haalbaar is om de γ-H2AX foci assay uit te voeren met slechts een druppel bloed (vingerprik)31. Een vergelijkbare aanpak werd gebruikt bij de ontwikkeling van het volledig geautomatiseerde high-throughput RABIT-systeem (Rapid Automated Biodosimetry Tool), dat werd geoptimaliseerd om γ-H2AX-opbrengsten te meten van van vingerprikken afgeleide bloedmonsters32,33. Over het algemeen suggereren de resultaten van de multibiodose- en RENEB-vergelijkingsstudies dat de γ-H2AX-foci-assay een zeer nuttig triage-instrument zou kunnen zijn na een recente (tot 24 uur) acute blootstelling aan straling12,13,14. In een intervergelijkingsstudie met een laag dosisbereik kon een dosis zo laag als 10 mGy worden onderscheiden van de schijnbestraalde controlemonsters, wat de gevoeligheid van de test in het lage dosisbereik benadrukte34. Het is belangrijk op te merken dat de hoge gevoeligheid van de test met name geldt voor lymfocyten, waardoor ze een van de meest geschikte celtypen zijn voor de evaluatie van blootstellingen aan lage doses. Lymfocyten zijn voornamelijk niet-fietsende cellen en vertegenwoordigen een synchrone populatie. Dit laatste vermijdt expressie van γ-H2AX geassocieerd is met DNA-replicatie, wat de gevoeligheid van de test om stralingsgeïnduceerde DSB te detecteren tijdens G2- en S-fase van de celcyclus aanzienlijk vermindert35. Naast de gevoeligheid voor lage doses voor lymfocyten, is de doorlooptijd van de γ-H2AX foci assay aanzienlijk sneller dan cytogenetische technieken zoals de dicentrische en micronucleus assay, omdat het geen stimulatie van lymfocyten vereist. Daarom kunnen resultaten binnen enkele uren worden verkregen in vergelijking met een paar dagen voor cytogenetische technieken. Een groot nadeel van de test is de snelle verdwijning van het γ-H2AX-focisignaal, dat normaal gesproken binnen enkele dagen na de blootstelling aan straling tot uitgangsniveaus zal worden teruggebracht, afhankelijk van de DNA-reparatiekinetiek36. Daarom is de meest geschikte toepassing van de test in een biodosimetriecontext voor initiële triagedoeleinden en om prioriteit te geven aan meer tijdrovende cytogenetische biologische dosimetrie-follow-up voor bepaalde slachtoffers. Voor nauwkeurige retrospectieve biodosimetrie en langetermijneffecten moet men echter vertrouwen op cytogenetische technieken zoals driekleurige FISH-analyses voor de detectie van stabiele chromosomale afwijkingen in het geval de blootstelling enkele jaren geleden plaatsvond10.
Als onderdeel van verschillende biodosimetrie-initiatieven zijn meerdere assays geëvalueerd voor triagedoeleinden naast de γ-H2AX foci assay om mensen in grootschalige radiologische noodsituaties te triage; zoals de dicentrische test, de cytokinese-blok micronucleus assay, elektron paramagnetische resonantie (EPR), serum eiwit assay (SPA), huid spikkel assay (SSA), optisch gestimuleerde luminescentie (OSL), evenals genexpressie analyse 37,38. De γ-H2AX foci assay kan kwantitatief worden gebruikt voor de evaluatie van DNA DSB-vorming en reparatie39. De test is echter tijdsafhankelijk omdat het niveau van γ-H2AX-foci varieert met de tijd na bestraling als gevolg van de DNA DSB-reparatiekinetiek40. Een vergelijkende studie illustreerde dat microscopische scoring met z-fase capaciteit de meest nauwkeurige resultaten biedt na 1 Gy bestraling, terwijl flowcytometrie alleen betrouwbare resultaten geeft bij hogere doses IR41. Er zijn veel rapporten over de ontwikkeling van beeldanalyse-oplossingen voor gebruik bij geautomatiseerde scores42,43,44,45,46. In dit protocol wordt een geautomatiseerd fluorescerend microscopieplatform met hoge doorvoer gebruikt om γ-H2AX-foci in perifere bloedlymfocyten te analyseren. Het gebruik van een automatisch scoresysteem vermijdt zowel interlaboratorium- als interwaarnemer scoringsbias, terwijl het nog steeds voldoende gevoeligheid mogelijk maakt om doses onder 1 Gy47te detecteren. Het belangrijkste voordeel van dit systeem ten opzichte van gratis open-source software voor foci scoring is het feit dat het volledige proces van het scannen van dia’s tot het vastleggen en scoren geautomatiseerd is. Het concept van door de gebruiker definieerbare en op te slaan classificatoren garandeert reproduceerbaarheid die een onbevooroordeelde mate van kwaliteit aan de resultaten toevoegt. Daarom illustreert dit werk hoe γ-H2AX-foci-resultaten kunnen worden verkregen met behulp van een geautomatiseerde microscopische scan- en scoringsmethode die kan worden gebruikt wanneer bloedmonsters van mogelijk overbelichte personen worden ontvangen door radiobiologische laboratoria voor biologische dosimetriedoeleinden.
Dit protocol beschrijft een stapsgewijze procedure voor de geautomatiseerde fluorescerende microscopie-gebaseerde scoring van de γ-H2AX foci assay. Het illustreert het nut van de foci-assay als een tijdsefficiënte methode voor het analyseren van het aantal door straling geïnduceerde DNA DSB in perifere bloedlymfocyten om een biologische dosisbeoordeling uit te voeren in een stralingsongevalscenario waarbij individuen kunnen worden blootgesteld aan onbekende niveaus van IR.
In dit specifieke protocol werden PBMC’s in vitro bestraald om een in vivo blootstelling aan straling na te bootsen. Zodra de bestraling en de incubatietijd van een uur is voltooid, worden dia’s gemaakt met behulp van een cytocentrifuge om een concentratieplek van cellen op de dia te creëren. Het gebruik van een cytocentrifuge is van vitaal belang om gestandaardiseerde omstandigheden voor geautomatiseerde scoring te bereiken. Na voltooiing wordt een hydrofobe pen gebruikt om een cirkel rond de cellen te maken, om verspilling van reagentia te verminderen door de gebruiker in staat te stellen de kleuringsreagentia te lokaliseren. Dit type pen kan worden gebruikt in verschillende immunostainingtechnieken, zoals op paraffinesecties, bevroren secties en cytologiepreparaten. Verder is het belangrijk om een hydrofobe pen te selecteren die compatibel is met enzym- en fluorescerende detectiesystemen. Na de voorbereiding van de dia trad de fixatie en immunofluorescentie γ-H2AX-kleuring op. In dit protocol worden de cellen gedurende 20 minuten gefixeerd met behulp van 3% PFA in een PBS-oplossing. Om immunostaining te laten slagen, is het essentieel dat de morfologie van de cellen behouden blijft en dat de antigene plaatsen toegankelijk zijn voor de detectiereagentia die worden gebruikt. PFA is een relatief zacht middel voor fixatie en stabiliseert cellen met behoud van eiwitstructuren51. Optimalisatie-experimenten met hogere PFA-concentraties en langere fixatietijden resulteerden in een negatieve impact op de glijkwaliteit, maar verdere opslag (‘s nachts) in 0,5% PFA tot 24 uur leverde goede resultaten op.
Het primaire, 2F3 monoklonale antilichaam dat in dit protocol wordt gebruikt, reageert op histonvariant H2AX wanneer gefosforyleerd bij Serine 139 na DNA DSB-inductie. Het antilichaam kan binden aan het gefosforyleerde residu zonder kruisreactiviteit met andere gefosforyleerde histonen52. Aangezien dit een primair monoklonaal antilichaam van de muis is, werd een secundair antilichaam geselecteerd tegen de gastheersoort van het primaire antilichaam terwijl het werd opgevoed in een alternatieve gastheer, namelijk ezel-anti-muis (DAM)-TRITC. Hoewel immunofluorescente kleuring is gebaseerd op specifieke antilichaam-epitoopbinding, kunnen verschillende intermoleculaire krachten ook resulteren in niet-specifieke achtergrondkleuring. Om niet-specifieke binding te verminderen, is het belangrijk om een blokkerend reagens te gebruiken in immunofluorescente kleuringsprotocollen53; we gebruikten een BSA-oplossing. Bovendien moet voldoende tijd worden besteed aan deze blokkerende stap door de dia’s ten minste 20 minuten in de oplossing te laten voordat primaire en secundaire antilichaamkleuring plaatsvindt. Bovendien moet de BSA-oplossing ook worden gebruikt als verdunningsmiddel voor de primaire en secundaire antilichamen. Afhankelijk van de anti-γ-H2AX en secundaire antilichaam dat wordt gebruikt voor de kleuring, moet men overwegen om verschillende antilichaamverdunningen te testen om de optimale concentratie te bepalen. Voor een nauwkeurigere scoring kan een dubbele kleuring worden uitgevoerd, door extra DNA DSB-reparatie-eiwitantistoffen toe te voegen.
Een groot nadeel van dit type analyse is de noodzaak om zo snel mogelijk na blootstelling bloedmonsters te verkrijgen, omdat bekend is dat het maximale aantal foci binnen 48 uur na de bestraling weer tot normale niveaus afneemt. Daarom kan het nuttig zijn om, wanneer het tijdstip van stralingsongeval en daaropvolgende bloedafname bekend is, te werken met verschillende kalibratiecurven die op verschillende tijdstippen na in vitro bestraling zijn vastgesteld (bijv. 4, 8, 12 en 24 uur). Zoals echter al vermeld in het introductiegedeelte van het manuscript, ligt de kracht van de γ-H2AX foci assay in initiële, snelle triagedoeleinden en moet deze worden gebruikt om prioriteit te geven aan meer tijdrovende cytogenetische biologische dosimetrie. Een gecombineerd scenario waarin meerdere biodosimetriebiomarkers parallel worden gebruikt, zal de meest betrouwbare dosisschatting genereren en verschillende biodosimetrielaboratoria wereldwijd hebben hun krachten gebundeld om landelijke netwerken op te zetten die kunnen worden geactiveerd en gebruikt om meerdere, parallelle biodososimetriebeoordelingen door laboratoria met verschillende expertise mogelijk te maken37,54,55 . Daarnaast zijn er ontwikkelingen gaande voor supersnelle analyses zoals een mobiel laboratorium op of nabij de plaats van het ongeval56. Nieuwe, veelbelovende biodosimetriemethoden worden voortdurend ontwikkeld, wat hopelijk zal resulteren in een nog snellere en betrouwbaardere doorvoer in de toekomst57.
Voor het geautomatiseerde beeldanalysesysteem worden dia’s ingevoegd of geplaatst op het geautomatiseerde scanplatform of diapodium. Geef daarna de diadetails een naam en sla deze op in de juiste map op de aangesloten computer. Voor dit experiment is de geautomatiseerde detectie van kernen en foci gebaseerd op de respectievelijke classificatie-instellingen. Zorg er bij het maken van een classificator voor dat de geselecteerde classificatorinstellingen overeenkomen met het huidige celtype, de voorbereidingsomstandigheden en de immunofluorescente kleuring van het monster. Geschikte fluorescerende kanalen die overeenkomen met het excitatiespectrum van de primaire en secundaire antilichamen worden ingesteld in de classificator. De classificator maakt het mogelijk om indien nodig aanvullende scoringsparameters in te stellen (bijv. kerngrootte, fluorescerende intensiteit, zoals beschreven in punt 6.1). Als twee of meer DNA-reparatie-eiwitten (bijvoorbeeld γ-H2AX en 53BP1) worden gecombineerd in een experiment, is het systeem ook in staat om co-lokalisaties van signalen te detecteren. Ten eerste verwerft het systeem DAPI-beelden, past beeldverwerking toe en identificeert kernen met behulp van morfologische criteria die in de classificator zijn ingesteld. De TRITC-signalen worden verkregen met behulp van 10 z-stacks met een stapgrootte van 0,35 mm tussen de brandpuntsvlakken47. De classificator gebruikte de Direct Foci Count, waarbij het aantal verschillende TRITC-signalen binnen de kern wordt gescoord. Hier is het belangrijk om er rekening mee te houden dat bij toenemende stralingsdosis foci-signalen de neiging hebben om samen te smelten tot grotere objecten, wat resulteert in een onderschatting van het werkelijke foci-aantal als objecten direct worden geteld. Het was niet vereist voor de hier beschreven analyse, maar een extra stap met Corrected Foci Count kan worden geïmplementeerd om dit probleem op te lossen. Met dit laatste kan het systeem de grootte van de gedetecteerde signalen verkrijgen en deze dienovereenkomstig wegen. Het gebruik van beide telmethoden kan een meer realistische schatting geven van het werkelijke aantal foci bij hogere doses.
Om automatisch scannen te beginnen, wordt het scangebied bepaald door het 10x-objectief van de microscoop te gebruiken om een rechthoekig zoekgebied te maken door twee hoeken van het zoekveld te bevestigen met de linkermuisklik (Figuur 5), gevolgd door het scherpstellen van de startpositie. Het referentieobject wordt automatisch geselecteerd en de software vraagt de gebruiker om een referentiekern (met behulp van het 40x-objectief) voor elke dia scherp te stellen en te centreren. Nadat het zoeken is begonnen, gaat het systeem naar het midden van het zoekvenster van de eerste geselecteerde dia en vraagt het om het referentieobject te centreren en scherp te stellen. Dit object zal later worden gebruikt als een positieverwijzing om elke verschuiving in de posities van de cel te corrigeren. Het tweede doel van het referentieveld is de automatische lichtaanpassing, in de doorgelaten lichtmodus wordt het licht aangepast totdat het optimale lichtniveau is bereikt. In de fluorescentiemodus is het lichtniveau vast, maar de integratietijd van de CCD-camera kan worden verhoogd totdat het vereiste signaal is gemeten. Om een correcte lichtinstelling mogelijk te maken, moet de referentie objecten met typische vlekken bevatten. Het is belangrijk om geen veld te gebruiken dat artefacten heeft met een zeer hoge kleurintensiteit. Na de lichtaanpassing start het systeem de raster-autofocus op de rasterpositie die zich het dichtst bij het referentieveld bevindt. Het blijft velden scherpstellen op een regelmatig raster en beweegt in een meander naar de voor- en achterkant van het zoekvenster. Het scannen begint wanneer de raster-autofocus is voltooid. Het werkgebied wordt in een meanderpatroon veld na veld verplaatst om gegevens vast te leggen. Wanneer een cel wordt gedetecteerd, worden de positie en de galerijafbeelding opgeslagen en weergegeven op het scherm en wordt het aantal cellen bijgewerkt. Als er een microscoop-, fase- of feederfout optreedt, wordt de zoekopdracht automatisch geannuleerd. De enige stap waarbij er een handmatige interventie van de operator is, is tijdens het instellen van het scannen van dia’s. Dit is ook het punt waar een snelle kwaliteitscontrole plaatsvindt (luchtbellen, lage celnummers, vervaging van de fluorescerende signaalkleuringsartefacten) en waar kan worden besloten om het scannen van een dia van inferieure kwaliteit af te breken. Een zoekopdracht wordt beëindigd als de hele dia is gescand, als het maximale aantal cellen is bereikt of als de zoekopdracht is geannuleerd. Zodra de scan is voltooid, worden de gegevens gepresenteerd zoals te zien in Figuur 6. Als u gescande cellen wilt weergeven, wordt het venster Galerij geopend en kan elke cel worden bekeken (Figuur 7). Dit is een ander punt waar de operator een kwaliteitscontrole kan uitvoeren door de focus van de galerijafbeeldingen en het totale aantal cellen dat is gescoord te controleren. Als te veel cellen onscherp zijn of als er te weinig cellen door het systeem zijn gedetecteerd om een realistische dosisschatting te maken (bijvoorbeeld 100 cellen in plaats van de beoogde 1000 cellen), moet worden besloten om de dia en de automatische score uit te sluiten van de eindevaluatie. Alle gegevens zijn samengevat in histogrammen (Figuur 8), samen met informatie over de verdeling, de middelen en de standaarddeviatie van fociscores voor elke cel. De histogrammen kunnen ook worden gebruikt om subpopulaties van kernen te selecteren en weer te geven op basis van de geautomatiseerde bevindingen ter beoordeling. Statistische analyses van de resultaten worden uitgevoerd nadat de verdeling, het gemiddelde en de standaarddeviatie van het aantal foci per cel handmatig zijn geregistreerd. De grafiek kan worden gebruikt als een kalibratiecurve voor het maken van een dosisschatting van een biodososimetriemonster. Dit kan worden gedaan met behulp van de vergelijking van de trendlijn om een geschatte schatting te maken van de ontvangen dosis. Bovendien Figuur 9 illustreert dat het geautomatiseerde scannen gevoelig genoeg is om foci geïnduceerd bij lage doses te detecteren. Bovendien tonen de resultaten een duidelijke lineaire toename van het aantal foci per cel met dosis. Opgemerkt moet worden dat de resultaten alleen representatief zijn voor de gebruikte classificator, resultaten zullen verschillen voor verschillende classifierparameters. Daarom is het in het geval van een biodosimetrie-analyse belangrijk dat dezelfde classificator en diapreparaat worden gebruikt voor de biodosimetriemonsters als die welke zijn gebruikt om de kalibratiecurve vast te stellen die wordt gebruikt om de dosisschatting uit te voeren. Hoewel het buiten het bereik van deze studie viel, is het belangrijk op te merken dat de γ-H2AX foci assay ook kan worden gebruikt om gedeeltelijke lichaamsbestralingen te bepalen. De meeste accidentele blootstellingen aan straling zijn inhomogene of gedeeltelijke blootstellingen aan het lichaam, waarbij alleen een gelokaliseerd gebied van het lichaam een hoge dosisblootstelling ontving. Verschillende studies hebben aangetoond dat het mogelijk is om de γ-H2AX foci assay te gebruiken om de fractie van het lichaam die is doorstraald en de dosis voor de doorstraalde fractie te schatten42. Wanneer een bestraling van het hele lichaam plaatsvindt, zal er willekeurige inductie van DNA DSB in alle cellen plaatsvinden en kan men een Poisson-verdeling verwachten. Vergelijkbaar met cytogentische methoden waarbij de inductie van chromosomale afwijkingen de neiging heeft om overgedispergeerd te zijn in perifere bloedlymfocyten waar er een grote overvloed aan cellen is met meerdere afwijkingen en cellen met normale metafasen, dispersieanalyse van γ-H2AX-foci met behulp van een verontreinigde Poisson-methode voorgesteld over gedispergeerde foci-verdelingen58. Dit laatste werd ook bevestigd in in vivo experimenten met minivarkens en een resusaap59.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen de deelnemers aan het onderzoek bedanken voor hun bloeddonaties, evenals Nurse V. Prince voor het verzamelen van bloedmonsters. De financiële steun van de South African National Research Foundation (NRF) voor dit onderzoek wordt hierbij erkend. De geuite meningen en de conclusies waartoe wordt gekomen, zijn die van de auteurs en hoeven niet noodzakelijkerwijs aan de NRF te worden toegeschreven. Dit werk werd financieel ondersteund door de Internationale Organisatie voor Atoomenergie (IAEA), via een technisch samenwerkingsproject (nummer: URU6042) ter ondersteuning van W. Martínez-López, evenals het gecoördineerde onderzoeksproject E35010 (contractnummer: 22248).
Bovine serum albumin – BSA | Merck | A3059 | |
Coplin Jar | Sigma | S6016 | |
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) | Lasec | Glass2C29M2450Rec | |
Cryogenic Vials (1.2 mL) | WhiteSci | 607101 | |
Cytospin | Healthcare Technologies | JC370-12-L | |
Cytospin Clips | Healthcare Technologies | JC302 | |
Cytospin filter cards | Healthcare Technologies | JC307 | |
Cytospin Funnels | Healthcare Technologies | JC372 | |
DAM-TRITC | Invitrogen | A16022 | |
DAPI-Fluroshield | Sigma/Merck | F6057 | |
Ethanol | Kimix | ETD901 | |
Filter tips | WhiteSci | 200ul (312012) and 1000ul (313012) | |
Hydrochloric acid- HCl | Merck | ||
Histopaque | Sigma/Merck | 10771 | |
lithium–heparin collection tubes | The Scientific Group | 367526 | |
MetaSystems – Metafer | Metasystems | Azio Imager Z2: 195-041848 | |
NaOH | Merck | 221465 | |
NovoPen | Leica Biosystems | NCL-PEN | |
Paraformaldehyde | Sigma/Merck | 158127 | |
Phosphate-buffered saline Tablets | Separations | SH30028,02 | |
Pipettes | WhiteSci | P11037 and P1033 | X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage. |
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613402 / 100 μg | |
RPMI medium | WhiteSci | BE12-702F | |
Triton X-100 (Octoxinol 9) | Sigma/Merck | T-9284 | |
Tubes (15ml) | WhiteSci | 601002 | |
X-Tra adhesive slides – corner clipped | SMM Technologies | 3800200E |