يقدم هذا البروتوكول إعداد الشريحة والتهديف الآلي للاختبارات البؤرية γ-H2AX على الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي. لتوضيح طريقة وحساسية المقايسة ، تم تشعيع الخلايا اللمفاوية المعزولة في المختبر. هذه الطريقة الآلية للكشف عن الحمض النووي DSB مفيدة لتطبيقات قياس الجرعات البيولوجية سريعة وعالية الإنتاجية.
الإشعاع المؤين هو محفز قوي لتلف الحمض النووي ومسرطن موثق جيدا. ويشمل قياس الجرعات البيولوجية الكشف عن الآثار البيولوجية الناجمة عن التعرض للإشعاع المؤين لإجراء تقييم الجرعة الفردية. وهذا أمر وثيق الصلة بالموضوع في إطار حالات الطوارئ الإشعاعية، حيث تكون التقييمات الصحية والتخطيط للعلاج السريري للضحايا المعرضين للخطر حاسمة. وبما أن فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي (DSB) تعتبر الشكل الأكثر فتكا من تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع، يقدم هذا البروتوكول طريقة للكشف عن الحمض النووي DSB في عينات الدم. وتستند المنهجية إلى الكشف عن بروتين إصلاح الحمض النووي المسمى الفوسفوري الفلوري، أي γ-H2AX. استخدام منصة المجهر الآلي لتسجيل عدد من بؤر γ-H2AX لكل خلية يسمح بتحليل موحد مع انخفاض كبير في الوقت بدوره حولها. ولذلك، فإن γ-H2AX يمكن أن يكون واحدا من أسرع القياسات وأكثرها حساسية لقياس الجرعات البيولوجية. في هذا البروتوكول، سيتم معالجة عينات الدم الكامل من المتطوعين البالغين الأصحاء وإشعاعها في المختبر من أجل توضيح استخدام الفحص الآلي والحساس γ-H2AX لتطبيقات قياس الجرعات الحيوية. يتم استخدام نظام مسح الشرائح الآلي ومنصة التحليل مع المجهر الفلوري المتكامل ، والذي يسمح بتسجيل سريع وتلقائي ل DSB الحمض النووي بدرجة منخفضة من التحيز.
وقد أصبح الإشعاع المؤين منذ اكتشافه أداة لا غنى عنها في الممارسات الطبية والصناعية الحالية، وكذلك في التطبيقات الزراعية والعسكرية. ومع ذلك، فإن الاستخدام الواسع النطاق للأشعة تحت الحمراء يزيد أيضا من خطر التعرض المفرط للإشعاع لكل من العاملين المهنيين في مجال الإشعاع وكذلك لأفراد الجمهور. الأشعة تحت الحمراء هي مادة مسرطنة مادية معروفة يمكن أن تسبب تلف الحمض النووي بطريقة مباشرة أو غير مباشرة ، مما يؤدي إلى مخاطر صحية كبيرة 1،2. لذلك ، من المهم إجراء تقييم الجرعة ، لأن درجة التعرض تشكل خطوة أولية مهمة في إدارة حادث الإشعاع 1.
في حالة حدوث حالات طوارئ نووية أو إشعاعية واسعة النطاق ، يمكن أن يتراوح عدد تقييمات الجرعة التي تحتاج إلى إجراء من بضعة إلى آلاف الأشخاص اعتمادا على حجم الحادث3. في هذه السيناريوهات، قد يكون قياس الجرعات المادية غامضا أيضا (على سبيل المثال، إذا لم يتم ارتداء مقياس الجرعات بشكل صحيح) أو غير متوفر، عندما يشارك أفراد الجمهور. في حين يمكن استخدام الأعراض السريرية للفرز ، إلا أنها ليست بالضرورة محددة للإشعاع ويمكن أن تؤدي إلى تشخيص خاطئ. لذلك ، من المستحسن استخدام قياس الجرعات البيولوجية جنبا إلى جنب مع قياس الجرعات الفيزيائية والتقييمات السريرية. تسمح هذه الطريقة بتحليل التغيرات الناجمة عن الإشعاع على المستوى الخلوي وتمكن من تحديد الأفراد المعرضين بشكل لا لبس فيه الذين يحتاجون إلى علاج طبي4. يمكن للطبيب بعد ذلك استخدام هذا التقييم الجرعة البيولوجية لاستكمال إعادة بناء الجرعة المادية والتشخيصات السريرية الأخرى, من أجل وصف الرعاية الطبية المناسبة5. وستكون الحاجة إلى قياس الجرعات البيولوجية عالية بشكل خاص بالنسبة لفرز الإصابات وإدارتها طبيا عندما لا يكون سيناريو التعرض معروفا جيدا وعندما يكون الضحايا من أفراد الجمهور. والغرض الرئيسي من الفرز هو التمييز الفعال بين الأشخاص “القلقين بشكل جيد”، الذين يمكن أن تكون لديهم أعراض برودرومال ولكنهم لم يتلقوا جرعة عالية، وبين الأشخاص المعرضين الذين يحتاجون إلى مساعدة طبية فورية ورعاية متخصصة. مستوى عتبة الجرعة الإشعاعية التي يمكن أن تسبب مرض الإشعاع هو حوالي 0.75 – 1.00 Gy. ثم, هؤلاء الأفراد الذين يتلقون > 2 Gy التعرض هم أكثر عرضة للإصابة بمتلازمة الإشعاع الحاد وينبغي أن تتلقى العلاج الطبي الفوري6,7. وتكون تقديرات الجرعة البيولوجية الدقيقة في الوقت المناسب للضحايا الذين وقعوا في مرمى نيران هذه الكوارث حاسمة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن أيضا الراحة وطمأنة الضحايا المعرضين الحد الأدنى8.
تستخدم سلطات الحماية من الإشعاع علامات قياس الجرعات الحيوية المختلفة ، والتي تستند بشكل رئيسي إلى اكتشاف الضرر الوراثي الخلوي ، مثل الكروموسومات ثنائية المركز أو النوى الدقيقة ، في الخلايا الليمفاوية البشرية المستزرعة9. الكشف عن الضرر الوراثي الخلوي يمكن أيضا أن يتم عن طريق الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) نقل المقايسة10. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي للطرق الوراثية الخلوية التقليدية هو وقت التحول الطويل للحصول على النتائج في حالة الطوارئ8.
واحدة من أقدم الخطوات في عملية التعرف على الحمض النووي DSB هو الفوسفور من البديل الهستون H2AX، مما يؤدي إلى تشكيل γ-H2AX، والتوظيف اللاحقة لعوامل الإصلاح. على مدى العقد الماضي، تلقى الكشف عن بؤر γ-H2AX الناجمة عن الإشعاع في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي باستخدام المجهر المناعي اهتماما متزايدا كأداة قياس الجرعات البيولوجية الموثوقة11،12،13،14،15. اعتمادا على جودة الإشعاع ونوع الخلية، يتم الكشف عن العائد الأقصى من بؤر γ-H2AX في غضون 0.5 – 1 ساعة بعد التشعيع16،17. ومن المتوقع أن يكون هناك ارتباط وثيق بين عدد الحمض النووي DSB و بؤر γ-H2AX، وكذلك بين اختفاء البؤر وإصلاح DSB. وقد أظهرت تجارب مقص الليزر مع ميكروب ليزر نبضي أن γ-H2AX بؤر توطين لمواقع الحمض النووي DSB18. في حين أنه لا يزال موضوعا للنقاش النشط، واحدة من الدراسات الأولى مع 125اقترحت علاقة واحدة إلى واحد بين العدد المحسوب من التفكك لكل خلية (قابلة لتمثيل لعدد من الحمض النووي الناجم عن الإشعاع DSB) وعدد بؤر γ-H2AX التي تم تسجيلها19،20.
على مدى العقد الماضي، مول الاتحاد الأوروبي مشروعي MULTIBIODOSE (أدوات قياس الأعماق الحيوية متعددة التخصصات لإدارة الإصابات الإشعاعية على نطاق واسع) ومشروع RENEB (تحقيق الشبكة الأوروبية لقياس الجرعات الحيوية) لإنشاء شبكة مستدامة في مجال قياس الجرعات البيولوجية وال بأثر رجعي21,22. وشمل هذا المشروع مختبرات مختلفة في جميع أنحاء أوروبا لتقييم قدرات الاستجابة لحالات الطوارئ في حالة الطوارئ الإشعاعية14,21,22. و γ-H2AX foci المقايسة لديها عدد من المزايا الكبيرة، مثل وقت المعالجة السريعة، وإمكانية معالجة دفعة السماح لسرعة الإنتاجية العالية، فضلا عن حساسيتها العالية إذا استخدمت في غضون ساعات قليلة بعد التعرض13,23,24. أدت الحساسية العالية للمقايسة في نطاق الجرعة المنخفضة إلى عدد من الدراسات التي استخدم فيها اختبار بؤر γ-H2AX كمؤشر على تأثير التعرض للإشعاع الطبي ، سواء في العلاج الإشعاعي أو في تطبيقات التصوير التشخيصي25,26,27,28,29,30. وهذه الخصائص تجعل من γ-H2AX foci asay بديلا تنافسيا للغاية للأساليب الأخرى للفرز المبكر في الحوادث النووية الكبيرة لفصل الأشخاص المعرضين بشدة عن الأفراد ذوي المخاطر المنخفضة. وقد أوضحت العديد من التجارب التحسين أنه من الممكن إجراء γ-H2AX foci المقايسة مع كميات صغيرة من الدم، مثل دراسة موكيه وآخرون الذين أفادوا أنه من الممكن إجراء γ-H2AX foci المقايسة مع قطرة دم فقط (وخز الإصبع)31. وقد استخدم نهج مماثل في تطوير نظام RABIT (أداة القياس البيولوجي الآلي السريع) المؤتمت بالكامل والذي تم تحسينه لقياس غلة γ-H2AX من عينات الدم المشتقة من عصا الإصبع32,33. وبشكل عام، تشير نتائج الدراسات المقارنة بين MULTIBIODOSE وRENEB إلى أن اختبار بؤر γ-H2AX يمكن أن يكون أداة فرز مفيدة للغاية بعد التعرض للإشعاع الحاد مؤخرا (حتى 24 ساعة)12,13,14. في دراسة مقارنة بين نطاق الجرعة المنخفضة ، يمكن تمييز جرعة منخفضة يصل إلى 10 mGy عن عينات التحكم المشععة ، مما يسلط الضوء على حساسية المقايسة في نطاق الجرعة المنخفضة34. من المهم ملاحظة أن الحساسية العالية للمقايسة صحيحة بشكل خاص للخلايا الليمفاوية ، مما يجعلها واحدة من أنسب أنواع الخلايا لتقييم التعرض للجرعات المنخفضة. الخلايا الليمفاوية هي أساسا خلايا غير ركوب الدراجات وتمثل السكان متزامن. هذا الأخير يتجنب التعبير عن γ-H2AX يرتبط مع تكرار الحمض النووي، مما يقلل بشكل كبير من حساسية المقايسة للكشف عن DSB الناجم عن الإشعاع خلال G2 و S-المرحلة من دورة الخلية35. بالإضافة إلى حساسيته للجرعات المنخفضة للخلايا الليمفاوية ، فإن وقت التحول في فحص بؤر γ-H2AX أسرع بكثير من التقنيات الجينية الخلوية مثل المقايسة ثنائية المركز والنووية الدقيقة ، لأنها لا تتطلب تحفيز الخلايا الليمفاوية. لذلك، يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعات قليلة مقارنة مع بضعة أيام للتقنيات الوراثية الخلوية. ومن العيوب الرئيسية للمقايسة الاختفاء السريع لإشارة بؤر γ-H2AX، التي عادة ما تنخفض إلى مستويات خط الأساس في غضون أيام بعد التعرض للإشعاع اعتمادا على الحركية إصلاح الحمض النووي36. ولذلك، فإن أنسب تطبيق للمقايسة في سياق قياس الجرعات الحيوية هو لأغراض الفرز الأولية وإعطاء الأولوية لمتابعة قياس الجرعات البيولوجية الجينية الخلوية الأكثر استهلاكا للوقت بالنسبة لبعض الضحايا. ومع ذلك ، لقياس الجرعات الحيوية بأثر رجعي دقيق والآثار على المدى الطويل ، يجب على المرء الاعتماد على التقنيات الجينية الخلوية مثل تحليلات FISH ثلاثية الألوان للكشف عن الانحرافات الكروموسومية المستقرة في حالة حدوث التعرض قبل عدة سنوات10.
وكجزء من عدة مبادرات لقياس الجرعات الحيوية، تم تقييم العديد من المقاييس لأغراض الفرز بجانب المقايسة البؤرية γ-H2AX لفرز الأشخاص في حالات الطوارئ الإشعاعية الواسعة النطاق؛ مثل المقايسة ثنائية المركز، و المقايسة الميكرونوكليوس كتلة السيتوكينيز، الرنين المغناطيسي الإلكترون (EPR)، فحص بروتين المصل (SPA)، فحص بقع الجلد (SSA)، التلألؤ المحفز بصريا (OSL)، فضلا عن تحليل التعبير الجيني 37،38. يمكن استخدام γ-H2AX foci المقايسة كميا لتقييم تشكيل الحمض النووي DSB وإصلاح39. ومع ذلك ، فإن المقايسة تعتمد على الوقت حيث يختلف مستوى بؤر γ-H2AX مع مرور الوقت بعد التشعيع بسبب الحركية إصلاح الحمض النووي DSB40. وأوضحت دراسة مقارنة أن التهديف المجهري مع قدرة z-المرحلة يقدم النتائج الأكثر دقة بعد 1 غي من الإشعاع، في حين أن قياس التدفق الخلوي يعطي فقط نتائج موثوقة بجرعات أعلى من الأشعة تحت الحمراء41. هناك العديد من التقارير عن تطوير حلول تحليل الصور لاستخدامها في تسجيل الآلي42،43،44،45،46. في هذا البروتوكول، يتم استخدام منصة المجهر الفلوري الآلي عالية الإنتاجية لتحليل بؤر γ-H2AX في الخلايا الليمفاوية الطرفية في الدم. استخدام نظام التهديف التلقائي يتجنب التحيز التهديف بين المختبر وبين المراقبين، في حين أنه لا يزال يسمح حساسية كافية للكشف عن جرعات أقل من 1 غي47. الميزة الأساسية لهذا النظام مقارنة مع البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر لتسجيل بؤر هو حقيقة أن العملية الكاملة من مسح الشرائح لالتقاط وتسجيل الآلي. مفهوم المصنفات القابلة للتعريف والمستور يضمن القابلية لإعادة الإنتاج مما يضيف درجة غير متحيزة من الجودة إلى النتائج. ولذلك، يوضح هذا العمل كيف يمكن الحصول على نتائج بؤر γ-H2AX باستخدام طريقة المسح المجهري الآلي والتهديف التي يمكن استخدامها عندما يتم تلقي عينات الدم من الأفراد الذين يحتمل أن يكونوا أكثر تعرضا من قبل مختبرات البيولوجيا الإشعاعية لأغراض قياس الجرعات البيولوجية.
يصف هذا البروتوكول إجراء تدريجيا لتسجيل النقاط الآلي القائم على المجهر الفلوري لمقايس بؤر γ-H2AX. وهو يوضح فائدة فحص بؤر كوسيلة فعالة من حيث الوقت لتحليل عدد DSB الحمض النووي الناجم عن الإشعاع في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي لإجراء تقييم الجرعة البيولوجية في سيناريو حادث الإشعاع حيث قد يتعرض الأفراد لمستويات غير معروفة من الأشعة تحت الحمراء.
وفي هذا البروتوكول المحدد، تم تشعيع مركبات ثنائي الفينيل متعددة البروم في المختبر لمحاكاة التعرض للإشعاع في الجسم الحي. بمجرد الانتهاء من التشعيع ووقت الحضانة لمدة ساعة واحدة ، يتم إجراء الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي للخلايا لإنشاء بقعة تركيز من الخلايا على الشريحة. استخدام جهاز الطرد الخلوي أمر حيوي لتحقيق شروط موحدة لتسجيل الآلي. عند الانتهاء، يتم استخدام قلم مسعور لجعل دائرة حول الخلايا، للحد من هدر الكواشف عن طريق السماح للمستخدم لترجمة الكواشف تلطيخ. يمكن استخدام هذا النوع من القلم في تقنيات مختلفة لاحتواء المناعة مثل أقسام البارافين والأقسام المجمدة ومستحضرات علم الخلايا. وعلاوة على ذلك، من المهم اختيار قلم مسعور متوافق مع أنظمة الكشف القائمة على الإنزيم والفلورسنت. بعد إعداد الشريحة ، حدث التثبيت والفلورة المناعية γ-H2AX. في هذا البروتوكول، يتم إصلاح الخلايا باستخدام 3٪ PFA في حل PBS لمدة 20 دقيقة. ولكي ينجح الاحتواء المناعي، من الضروري الاحتفاظ بمورفولوجيا الخلايا وأن تكون المواقع المضادة للجينات في متناول كاشفات الكشف المستخدمة. PFA هو عامل لطيف نسبيا لتثبيت واستقرار الخلايا مع الحفاظ على هياكل البروتين51. أدت تجارب التحسين مع تركيزات PFA أعلى وأوقات تثبيت أطول في تأثير سلبي على جودة الشريحة، ولكن المزيد من التخزين (بين عشية وضحاها) في 0.5٪ PFA تصل إلى 24 ساعة أسفرت عن نتائج جيدة.
الأجسام المضادة الأولية، 2F3 أحادية النسيلة المستخدمة في هذا البروتوكول يتفاعل مع البديل الهستون H2AX عندما الفوسفور في سيرين 139 بعد التعريفي DSB الحمض النووي. الأجسام المضادة قادرة على ربط بقايا الفوسفور مع عدم وجود التفاعل مع غيرها من histones الفوسفورية52. وبما أن هذا جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر الأساسي، فقد تم اختيار جسم مضاد ثانوي ضد الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية أثناء تربيته في مضيف بديل، وهو الحمار المضاد للفأرة (DAM)-TRITC. في حين أن تلطيخ immunofluorescent يستند إلى ربط الأجسام المضادة محددة epitope، يمكن أن تؤدي العديد من القوى بين الجزيئيات أيضا في تلطيخ الخلفية غير محددة. من أجل الحد من الربط غير محددة، من المهم استخدام كاشف منع في بروتوكولات تلطيخ immunofluorescent53؛ استخدمنا حل BSA. وعلاوة على ذلك، ينبغي تخصيص وقت كاف لهذه الخطوة حظر عن طريق ترك الشرائح في الحل لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل تلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام محلول BSA كمثانة للأجسام المضادة الأولية والثانوية. اعتمادا على المضادة γ-H2AX والأجسام المضادة الثانوية التي تستخدم لتلطيخ, ينبغي للمرء أن تنظر في اختبار مختلف تمييع الأجسام المضادة من أجل تحديد التركيز الأمثل. لتسجيل أكثر دقة، يمكن إجراء تلطيخ مزدوج، عن طريق إضافة الحمض النووي DSB إضافية إصلاح الأجسام المضادة للبروتين.
ومن العيوب الرئيسية لهذا النوع من التحليل الحاجة إلى الحصول على عينات الدم في أقرب وقت ممكن بعد التعرض، حيث من المعروف أن الحد الأقصى لعدد البؤر ينخفض مرة أخرى إلى المستويات الطبيعية في غضون 48 ساعة بعد التشعيع. لذلك، عندما يعرف وقت وقوع حادث إشعاعي وأخذ عينات الدم اللاحقة، قد يكون من المفيد العمل مع منحنيات معايرة مختلفة تم تحديدها في نقاط زمنية مختلفة بعد التشعيع في المختبر (على سبيل المثال، 4 و8 و12 و24 ساعة). ومع ذلك، وكما سبق ذكره في قسم مقدمة المخطوطة، تكمن قوة المقايسة البؤرية γ-H2AX في أغراض الفرز الأولي والسريع وينبغي استخدامها لتحديد أولويات قياس الجرعات البيولوجية الجينية الخلوية الأكثر استهلاكا للوقت. سيناريو مشترك حيث يتم استخدام المؤشرات الحيوية متعددة قياس الجرعات الحيوية بالتوازي، وسوف تولد تقدير الجرعة الأكثر موثوقية ومختلف مختبرات قياس الجرعات الحيوية في جميع أنحاء العالم قد تضافرت جهودها لإنشاء شبكات على الصعيد الوطني التي يمكن تفعيلها واستخدامها للسماح تقييمات متعددة، محاكاة حيوية موازية من قبل مختبرات ذات خبرة مختلفة37،54،55 . بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال التطورات جارية لتحليل فائق السرعة مثل مختبر متنقل في أو بالقرب من موقع الحادث56. ويجري باستمرار تطوير أساليب جديدة واعدة لقياس الجرعات الحيوية، مما سيؤدي إلى إنتاجية أسرع وأكثر موثوقية في المستقبل57.
بالنسبة لنظام تحليل الصور التلقائي، يتم إدخال الشرائح أو وضعها على منصة المسح الآلي أو مرحلة الشريحة. بعد ذلك، قم بتسمية تفاصيل الشريحة وحفظها في المجلد المناسب على الكمبيوتر المرفق. لهذه التجربة، يستند الكشف الآلي عن النوى والمفتوح على إعدادات المصنف المعنية. عند إنشاء مصنف، تأكد من تطابق إعدادات المصنف المحددة مع نوع الخلية الحالي وظروف التحضير وتلطيخ العينة immunofluorescent. يتم تعيين قنوات الفلورسنت المناسبة مطابقة الطيف الإثارة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية في المصنف. يسمح المصنف بوضع معلمات تسجيل إضافية إذا لزم الأمر (على سبيل المثال، حجم النواة، كثافة الفلورسنت، كما هو موضح في القسم 6.1). إذا تم الجمع بين اثنين أو أكثر من بروتينات إصلاح الحمض النووي (على سبيل المثال، γ-H2AX و 53BP1) في تجربة، فإن النظام قادر أيضا على اكتشاف التوطين المشترك للإشارات. أولا، يكتسب النظام صور DAPI، ويطبق معالجة الصور، ويحدد النوى باستخدام المعايير المورفولوجية المحددة في المصنف. يتم الحصول على إشارات TRITC باستخدام 10 z-مداخن مع حجم خطوة من 0.35 مم بين الطائرات المحورية47. استخدم المصنف عدد البؤر المباشر ، حيث يتم تسجيل عدد إشارات TRITC المتميزة داخل النواة. وهنا، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه مع زيادة جرعة الإشعاع، تميل إشارات البؤر إلى الاندماج في أجسام أكبر، مما يؤدي إلى التقليل من شأن عدد البؤر الفعلي إذا تم حساب الأجسام مباشرة. لم يكن مطلوبا للتحليل الموضح هنا، ولكن يمكن تنفيذ خطوة إضافية مع تصحيح عدد Foci لحل هذه المشكلة. هذا الأخير يسمح للنظام للحصول على أحجام الإشارات المكتشفة ويزن لهم وفقا لذلك. يمكن استخدام كل من طرق العد توفير تقدير أكثر واقعية من العدد الفعلي لل البؤر بجرعات أعلى.
لبدء المسح الآلي، يتم تحديد منطقة المسح باستخدام الهدف 10x من المجهر لجعل منطقة البحث مستطيلة عن طريق تحديد ركنين من أركان حقل البحث عن طريق النقر الأيسر من الماوس (الشكل 5) ، متبوعا بتركيز موضع البداية. يتم تحديد الكائن المرجعي تلقائيا، ويطالب البرنامج المستخدم بالتركيز على نواة مرجعية (باستخدام الهدف 40x) لكل شريحة وتوسيطها. بعد بدء البحث، سينتقل النظام إلى مركز نافذة البحث في الشريحة المحددة الأولى وسيطلب توسيط وتركيز الكائن المرجعي. سيتم استخدام هذا الكائن لاحقا كمرجع موضع لتصحيح أي إزاحة في موضع الخلية. الغرض الثاني من الحقل المرجعي هو ضبط الضوء التلقائي ، في وضع الضوء المرسل يتم ضبط الضوء حتى يتم الوصول إلى مستوى الضوء الأمثل. في وضع الفلورسينس يتم إصلاح مستوى الضوء، ولكن يمكن زيادة وقت تكامل كاميرا CCD حتى يتم قياس الإشارة المطلوبة. لتمكين ضبط الضوء الصحيح، يجب أن يحتوي المرجع على كائنات ذات تلطيخ نموذجي. من المهم عدم استخدام حقل يحتوي على قطع أثرية ذات كثافة تلطيخ عالية جدا. بعد ضبط الضوء، يبدأ النظام التركيز البؤري التلقائي للشبكة في موضع الشبكة الأقرب إلى الحقل المرجعي. وهي تواصل تركيز الحقول على شبكة منتظمة، وتتحرك في تعرج نحو الجزء الأمامي والخلف من نافذة البحث. يبدأ المسح الضوئي عند اكتمال التركيز البؤري التلقائي للشبكة. يتم نقل المرحلة في حقل نمط تعرج بعد حقل لالتقاط البيانات. عند اكتشاف خلية، يتم تخزين موضعها وصورة المعرض وعرضها على الشاشة ويتم تحديث عدد الخلايا. في حالة حدوث خطأ في المجهر أو المرحلة أو وحدة التغذية، يتم إلغاء البحث تلقائيا. الخطوة الوحيدة التي يوجد فيها تدخل يدوي من المشغل، هي أثناء إعداد مسح الشرائح. هذه هي أيضا النقطة التي يتم فيها فحص مراقبة الجودة السريع (فقاعات الهواء ، أرقام الخلايا المنخفضة ، تلاشي القطع الأثرية لتلطيخ الإشارات الفلورية) وحيث يمكن أن يتقرر إجهاض مسح شريحة ذات جودة رديئة. يتم إنهاء البحث إذا تم مسح الشريحة بأكملها ضوئيا، أو إذا تم الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا، أو إذا تم إلغاء البحث. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي ، يتم تقديم البيانات كما رأينا في الشكل 6. لعرض الخلايا الممسوحة ضوئيا، يتم فتح نافذة المعرض ويمكن عرض كل خلية (الشكل 7). هذه نقطة أخرى حيث يمكن للمشغل إجراء مراقبة الجودة عن طريق التحقق من تركيز صور المعرض والعدد الإجمالي للخلايا التي تم تسجيلها. إذا كان هناك عدد كبير جدا من الخلايا خارج التركيز أو تم الكشف عن خلايا قليلة جدا من قبل النظام لإجراء تقدير جرعة واقعية (على سبيل المثال، 100 خلية بدلا من الخلايا 1000 المقصود)، ثم ينبغي اتخاذ قرار لاستبعاد الشريحة والنتيجة التلقائية من التقييم النهائي. يتم تلخيص جميع البيانات في المدرجات التكرارية (الشكل 8) ، إلى جانب معلومات حول التوزيع والوسائل والانحراف المعياري لل البؤر المسجلة لكل خلية. ويمكن أيضا استخدام المدرجات التكرارية لاختيار وعرض مجموعات فرعية من النوى استنادا إلى النتائج الآلية للمراجعة. يتم إجراء التحليلات الإحصائية على النتائج بعد التوزيع، المتوسط، وقد تم تسجيل الانحراف المعياري للرقم البؤر لكل خلية يدويا. يمكن استخدام الرسم البياني كمنحنى معايرة لإجراء تقدير الجرعة لعينة قياس الجرعات الحيوية. ويمكن القيام بذلك باستخدام معادلة خط الاتجاه لإجراء تقدير تقريبي للجرعة المتلقاة. علاوة على ذلك الشكل 9 يوضح أن المسح الآلي حساس بما يكفي للكشف عن البؤر الناجمة بجرعات منخفضة. وعلاوة على ذلك، تظهر النتائج زيادة خطية واضحة لعدد البؤر لكل خلية مع الجرعة. وتجدر الإشارة إلى أن النتائج هي ممثل فقط للمصنف المستخدمة، وسوف تختلف النتائج لمعلمات مصنف مختلفة. لذلك، في حالة تحليل قياس الجرعات الحيوية، من المهم أن يتم استخدام نفس المصنف وإعداد الشريحة لعينات قياس الجرعة الحيوية مثل تلك التي تم استخدامها لإنشاء منحنى المعايرة الذي يستخدم لأداء تقدير الجرعة. في حين أنه كان خارج نطاق هذه الدراسة، من المهم أن نلاحظ أن γ-H2AX foci المقايسة يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد تشعيع الجسم الجزئي. معظم التعرضات العرضية للإشعاع هي التعرض غير المتجانس أو الجزئي للجسم، حيث لم تتلق سوى منطقة محلية من الجسم جرعة عالية من التعرض. أوضحت العديد من الدراسات أنه من الممكن استخدام γ-H2AX foci تقدير جزء الجسم الذي تم تشعيعه والجرعة إلى الكسر المشعع42. عندما يحدث تشعيع كامل الجسم ، سيكون هناك تحريض عشوائي من الحمض النووي DSB في جميع الخلايا ويمكن للمرء أن يتوقع العثور على توزيع بواسون. على غرار الطرق الخلوية حيث يميل تحريض الانحرافات الكروموسومية إلى أن يكون أكثر من مشتتة في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي حيث توجد وفرة عالية من الخلايا مع انحرافات متعددة وخلايا مع metaphases العادية ، وتحليل تشتت بؤر γ H2AX باستخدام طريقة بواسون الملوثة المقترحة على توزيعات بؤر متفرقة58. وتأكد أيضا أن هذا الأخير في in vivo تجارب مع الخنازير الصغيرة والمكاك ريسوس59.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون أن يشكروا المشاركين في الدراسة على تبرعاتهم بالدم، وكذلك الممرضة ف. برنس على جمع عينات الدم. 12- ويعترف بموجب هذا بالمساعدة المالية المقدمة من مؤسسة البحوث الوطنية لجنوب أفريقيا في هذا البحث. والآراء التي أعرب عنها والاستنتاجات التي تم التوصل إليها هي آراء أصحاب البلاغ ولا تنسب بالضرورة إلى الصندوق الوطني لرعاية المسنين. وقد دعم هذا العمل ماليا الوكالة الدولية للطاقة الذرية، من خلال مشروع للتعاون التقني (رقم: URU6042) لدعم و. مارتينيز لوبيز، فضلا عن مشروع البحوث المنسقة E35010 (رقم العقد: 22248).
Bovine serum albumin – BSA | Merck | A3059 | |
Coplin Jar | Sigma | S6016 | |
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) | Lasec | Glass2C29M2450Rec | |
Cryogenic Vials (1.2 mL) | WhiteSci | 607101 | |
Cytospin | Healthcare Technologies | JC370-12-L | |
Cytospin Clips | Healthcare Technologies | JC302 | |
Cytospin filter cards | Healthcare Technologies | JC307 | |
Cytospin Funnels | Healthcare Technologies | JC372 | |
DAM-TRITC | Invitrogen | A16022 | |
DAPI-Fluroshield | Sigma/Merck | F6057 | |
Ethanol | Kimix | ETD901 | |
Filter tips | WhiteSci | 200ul (312012) and 1000ul (313012) | |
Hydrochloric acid- HCl | Merck | ||
Histopaque | Sigma/Merck | 10771 | |
lithium–heparin collection tubes | The Scientific Group | 367526 | |
MetaSystems – Metafer | Metasystems | Azio Imager Z2: 195-041848 | |
NaOH | Merck | 221465 | |
NovoPen | Leica Biosystems | NCL-PEN | |
Paraformaldehyde | Sigma/Merck | 158127 | |
Phosphate-buffered saline Tablets | Separations | SH30028,02 | |
Pipettes | WhiteSci | P11037 and P1033 | X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage. |
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613402 / 100 μg | |
RPMI medium | WhiteSci | BE12-702F | |
Triton X-100 (Octoxinol 9) | Sigma/Merck | T-9284 | |
Tubes (15ml) | WhiteSci | 601002 | |
X-Tra adhesive slides – corner clipped | SMM Technologies | 3800200E |